Kvantitativ cytometri er en relativt ny teknik til mikrobiologisk undersøgelse af dispersionsmedier, udført ved hjælp af specialudstyr. Cytometrien er statisk og flydende.
Statisk cytometri udføres ved hjælp af konfokale mikroskoper;I mangel af dem er lidt modificerede luminescerende mikroskoper udstyret med enkle og billige billedanalysesystemer.
Flowcytometri udføres på specielle enheder - sorter og flow-cytrometre.
Begge varianter af kvantitativ cytometri har den bredest mulige anvendelse i udøvelsen af medicinsk og biologisk forskning. På trods af forskellen i det anvendte kliniske materiale og de eksperimentelle modeller er de opgaver, de løser, underlagt de generelle principper for undersøgelsen.
Hvad er flowcytometri?
flowcytometri teknik kaldet undersøgelse stoffer i dispersionen tilstand enkeltartikeludtager analysere partikler omfattende den dispergerede fase af signaler modtaget ved fluorescens og lysspredning.
Flowcytometriteknikken blev udviklet på basis af specielle eksperimenter for at bestemme størrelsen på de undersøgte partikler og tælle deres antal.
første cellesorterer blev skabt i 1965 år, men siden begyndelsen af det næste årti blev arrangeret produktion af indretninger til måling af fluorescensintensiteter ved flere bølgelængder for at bestemme flere parametre for den undersøgte celle.
for forskere Moderne flowcytometri instrumenter anvendes to typer:
- Instrumenter til måling af fluorescens ved to( eller flere) bølgelængder og lysspredning ved en vinkel på ti( den såkaldte små-vinkel fremad spredning) og halvfems grader. Enheder af denne type er nemme at bruge.
- Små besværlige cellesortere, der kan måle mere end fem parametre af de undersøgte kerner eller partikler, og også sortere celler, der har et bestemt sæt parametre.
enhed avancerede flowcytometre er så kompleks og forskelligartet, at det er svært at enhver generalisering og systematisering, men nogle generelle punkter, som er fælles for alle enheder, der stadig eksisterer:
- Til analyse på cytometret af enhver type kræver en homogen suspension af celler af en bestemt type.
- Der bør ikke være mangel på antallet af celler eller deres kerne.
- For at forhindre, at cellerne klæber sammen, skal forskeren have fuldstændig information om typen af lysets spredning og have tabeller med relevante data ved hånden.
Prøver
Under medicinske og biologiske studier blev prøver fremstillet af celler:
- af knoglemarv;
- blod;
- cerebrospinalvæske( CSF);
- af det synoviale( artikulære) væske;
- pleurvæske;
- peritoneal( ascites) væske, der akkumulerer i bukhulen under udvikling af ascites;
- af tumor og sunde væv.
Princip for flowcytometrimetoden
Principperne bag den cytometriske procedure er yderst simple.
suspensioner fremstillet af celler præ-mærkede med fluorescerende monoklonale antistoffer eller fluorokromer er placeret i strømmen af dispersionsmediet, transmitteres gennem flowcellen. Hydrodynamisk fokusering
cellesuspension jet i en strøm af dispersionsmediet fører til det faktum, at de undersøgte celler eller deres kerner er anbragt enkeltvis og i denne rækkefølge tværvange fokuseret lys( typisk laser) lys.
Lyset, der kommer fra fluorokromerne, er fokuseret ved hjælp af et optisk system bestående af flere spejle og linser og nedbrydes derefter til specifikke komponenter.
De modtagne lyssignaler udsættes for analyse og transformation i elektriske impulser og derefter til bestemte former, der er acceptable til computerbehandling og opbevaring af den modtagne information.
Fluorokrom
For at lette processen med at bestemme de cellulære strukturer under flowcytometriproceduren, er det anvendte dispersionsmedium farvet med specielle fluorescerende farvestoffer-fluorochromer.
Efter en sådan behandling erhverver de celler, der testes, evnen til at fluoresceres( lys) under påvirkning af en stråle af lysstråler.
Ved valg af farvestof anvendes et antal kriterier:
- Den anvendte fluorochrom skal være specifik for det DNA, der er under undersøgelse.
- Farvernes spektrale egenskaber skal svare til kapaciteten af det anvendte udstyr.
- En vigtig faktor er prisen for fluorochrom( den bør ikke være meget høj).
- De anvendte farvestoffer skal være nemme at anvende( har stabilitet og god opløselighed).
Et af de mest populære fluorokromer er propidiumiodid: dets spektrale egenskaber er ideelt til at udføre flowcytometri.
For at aktivere fluorescens ved hjælp af propidiumiodid, anvender forskere en konventionel argonlaser( dens arbejdsbølgelængde er 480 nm).Arealet af det fluorescerende afsnit er sådan, at det tillader os at anvende ovennævnte fluorokrom til at udføre multimarametre målinger.
For flowcytometri anvendes følgende også:
- fluorescein isothiocyanat;
- phycoerythrins( Cy5, Cy7, Texan red);
- alloficocyanin;
- Peridinin-Chlorophyll Protein.
Uanset hvilket farvestof der er involveret i proceduren, skal mængden være direkte proportional med indholdet af DNA i cellestrukturen.
For at opnå en kvalitativ farvning af alle cellulære strukturer skal mængden af anvendt fluorokrom være overdreven.
De fleste fluorkromer, som kommer i kontakt med DNA, er ikke i stand til at passere gennem membranerne i intakte celler. For at øge permeabiliteten af cellemembraner behandles de undersøgte celler med overfladeaktive midler( detergenter) eller med alkohol.
Fordele ved
De utvivlsomme fordele ved flowcytometri kan overvejes:
- Høj( op til hundrede tusinde episoder per sekund) analysehastighed.
- Evne til at bestemme cellulære subpopulationer.
- Evnen til at udføre analyse af et enormt( op til 108 elementer i en ml dispersionsmedium) af antallet af celler.
- Evne til at bestemme parametrene for nogen celler og cellulære strukturer( herunder sjældne).
- Høj grad af objektivitet ved måling af luminescensintensitet( fluorescens).
Hvor skal man ansøge?
Spektret for anvendelse af flowcytometri er usædvanligt bredt. Det bruges selv i branchen til at styre produktionsprocessen. Vi vil demonstrere dette ved at give oplysninger i form af lister for klarhed.
I onkologi
I denne sektion af medicin anvendes flowcytometri til:
- kvantificere intracellulære strukturer( DNA);
- undersøgelse af de vigtigste parametre i cellecyklussen;
- identifikation og tælling af celler, der tilhører forskellige perioder af cellecyklussen;
- påvisning af aneuploide kloner( unormale celler med ikke-standard kromosomsæt), der tyder på udviklingen af akut leukæmi;
- afslørende graden af proliferativ aktivitet( tendens til aktiv opdeling) af aneuploide kloner;
- påvisning af tumormarkører;
- overvåger status for patienter i fare;
- vurderer immunsystemets funktion og den funktionelle konsistens af immunceller;
- påvisning af subpopulationer af lymfocytter( denne egenskab gør det muligt at vurdere immunitetstilstanden).
Video om flowcytometri i diagnosen akut leukæmi:
Immunologi
Flowcytometrimetoden tillader:
- til at udføre immunophenotyping( bestemme type og funktionstilstand) for blodceller;
- etablerer den fagocytiske aktivitet af immunceller( dette er angivet ved indfangning af bakterier mærket med fluorescerende farvestoffer);
- identificerer intracellulære proteiner;
- bestemmer omfanget af proliferativ aktivitet;
- for at undersøge stadierne af cellecyklussen;
- vurdere graden af cytotoksicitet( beskyttende mekanisme til at ødelægge den subcellulære niveau til protozoer, bakterier og vira) celle. Cytologi
Flowcytometri giver omfattende data til:
- indstilles nøjagtigt cytomorphological eventuelle cellekarakteristika( dets størrelse, niveauet af asymmetri, forholdet mellem kerne og cytoplasma);
- evaluerer aktiviteten af de enzymer, der udgør cellen;
- analyserer stadierne af cellecyklussen;
- måler fysiologiske intracellulære parametre( pH-niveau, cellemembranpotentiale, koncentration af frie ioner).
Hæmatologi ved flowcytometri kan hæmatologer:
- analysere subpopulationer af blodceller;
- at tælle antallet af reticulocytter og blodplader ved hjælp af specifikke markører;
- vurderer konsekvenserne af resterende( resterende, ikke fuldt helbredet) sygdom;
- diagnosticere akut leukæmi;
- udføre en differentialdiagnose reaktiv lymfocytose og lymfoproliferative sygdomme( sygdomme, hvor de berørte celler med lymfoid art);
- til diagnosticering af sygdomme af lymfoproliferativ etiologi.
Pharmaceuticals
Flowcytometri hjælper farmakologer:
- sæt ekspressionsniveau( følsomhed af tumorer af forskellige lokaliseringer behandling narkotika) proteinmarkører;
- måler aktiviteten af enzymer, der udgør cellerne;
- engageret i undersøgelsen af virkningen af bioaktive stoffer på tilstanden af celler i menneskekroppen for at bestemme ethvert trin i cellecyklussen.
landbrug
fremgangsmåde til flowcytometri er almindeligt anvendt af videnskabsfolk har specialiseret sig i opdræt af nye anlæg og dyreavl, som gør det muligt at:
- bestemme ploiditet( antal identiske kromosom sæt i kernen) celler;
- udfører en analyse af ethvert trin i cellecyklussen;
- udfører analysen af indholdet af protoplaster( bakterie- eller planteceller) og sorterer dem også i overensstemmelse med de indstillede parametre.