La citometría cuantitativa es una técnica relativamente nueva para la investigación microbiológica de medios de dispersión, llevada a cabo con la ayuda de equipos especiales. La citometría es estática y fluida.
La citometría estática se realiza utilizando microscopios confocales;en ausencia de ellos, los microscopios luminiscentes ligeramente modificados están equipados con sistemas de análisis de imágenes simples y baratos.
La citometría de flujo se realiza en dispositivos especiales: clasificador y citómetros de flujo.
Ambas variantes de citometría cuantitativa tienen la aplicación más amplia posible en la práctica de la investigación médica y biológica. A pesar de la diferencia en el material clínico utilizado y los modelos experimentales, las tareas que resuelven están sujetas a los principios generales del estudio.
¿Qué es la citometría de flujo?
La citometría de flujo es una técnica para estudiar las sustancias de dispersión en el modo de análisis de piezas de partículas que forman parte de una fase dispersa a partir de señales obtenidas durante la fluorescencia y la dispersión de la luz.
La técnica de citometría de flujo se desarrolló sobre la base de experimentos especiales para determinar el tamaño de las partículas en estudio y contar su número.
primer separador de células fue creado en 1965 año, pero desde el comienzo de la próxima década se organizó la producción de dispositivos para la medición de la intensidad de fluorescencia en varias longitudes de onda para determinar varios parámetros de la célula estudiada.
para los investigadores flujo Modern citometría de instrumentos se utilizan dos tipos:
- Instrumentos para medir la fluorescencia a dos( o más) longitudes de onda y dispersión de la luz en un ángulo de diez( la denominada de ángulo pequeño de dispersión hacia adelante) y noventa grados. Los dispositivos de este tipo son fáciles de usar.
- Clasificadores de células bastante engorrosos que pueden medir más de cinco parámetros de los núcleos o partículas investigados, y también clasificar las células que tienen un cierto conjunto de parámetros.dispositivo
citómetros de flujo avanzadas son tan compleja y diversa que es difícil para cualquier generalización y sistematización, pero algunos puntos generales, común a todos los dispositivos, todavía existe:
- Para el análisis en el citómetro de cualquier tipo requiere una suspensión homogénea de células de un cierto tipo.
- No debe haber escasez del número de células o sus núcleos.
- Para evitar que las células se mantengan juntas, el investigador debe tener información completa sobre la naturaleza de la dispersión de la luz y tener tablas con datos relevantes a mano.
Muestras
Durante estudios médicos y biológicos, muestras preparadas a partir de células:
- de médula ósea;Sangre
- ;
- fluido cerebroespinal( CSF);
- del fluido sinovial( articular);
- fluido pleural;
- fluido peritoneal( ascitis) que se acumula en la cavidad abdominal durante el desarrollo de ascitis;
- de tumor y tejidos sanos.
Principio del método de citometría de flujo
Los principios subyacentes al procedimiento citométrico son extremadamente simples.
Una suspensión preparada a partir de células previamente marcadas con anticuerpos monoclonales fluorescentes o fluorocromos se coloca en un flujo de medio de dispersión que pasa a través de una celda de flujo. Enfoque hidrodinámico
chorro de suspensión de células en un flujo del medio de dispersión conduce al hecho de que las células investigadas o sus núcleos están dispuestos por separado y en este orden viga transversal centraron luz( típicamente láser) de luz.
La luz que emana de los fluorocromos se enfoca por medio de un sistema óptico que consiste en varios espejos y lentes, y luego se descompone en componentes específicos.
Las señales de luz recibidas se someten a análisis y transformación en pulsos eléctricos, y luego a ciertas formas aceptables para el procesamiento de la computadora y el almacenamiento de la información recibida.
Fluorochromes
Con el fin de facilitar el proceso de determinación de las estructuras celulares en la citometría de flujo procedimientos utilizados medio de dispersión coloreada con un colorante fluorescente especial - fluorocromos.
Después de tal tratamiento, las células bajo prueba adquieren la capacidad de emitir fluorescencia( luz) bajo la influencia de un haz de rayos de luz.
Al elegir un tinte, se utilizan varios criterios:
- El fluorocromo utilizado debe ser específico del ADN que se está investigando.
- Las características espectrales del tinte deben coincidir con las capacidades del equipo utilizado.
- Un factor importante es el costo del fluorocromo( no debe ser muy alto).
- Los colorantes utilizados deben ser fáciles de usar( tienen estabilidad y buena solubilidad).
Uno de los fluorocromos más populares es el yoduro de propidio: sus características espectrales son ideales para realizar citometría de flujo.
Para activar la fluorescencia usando yoduro de propidio, los investigadores recurren a un láser de argón convencional( su longitud de onda de trabajo es de 480 nm).El área de la sección fluorescente es tal que nos permite usar el fluorocromo mencionado anteriormente para realizar mediciones de múltiples parámetros.
Para la citometría de flujo, también se usa lo siguiente: isotiocianato de fluoresceína
- ;
- ficoeritrinas( Cy5, Cy7, rojo tejano);
- alloficocyanin;
- Peridinine-Chlorophyll Protein.
Independientemente de qué colorante esté involucrado en el procedimiento, su cantidad debe ser directamente proporcional al contenido de ADN en la estructura celular.
Con el fin de lograr una tinción cualitativa de todas las estructuras celulares, la cantidad de fluorocromo utilizado debe ser excesiva.
La mayoría de los fluorocromos que entran en contacto con el ADN no pueden pasar a través de las membranas de las células intactas( intactas).Para aumentar la permeabilidad de las membranas celulares, las células bajo investigación se tratan con surfactantes( detergentes) o con alcohol. Beneficios
indudable ventajas de citometría de flujo pueden ser considerados:
- alta( hasta cien mil episodios por segundo) la velocidad de análisis.
- Capacidad para determinar subpoblaciones celulares.
- La capacidad de realizar análisis de un gran( hasta 108 elementos en un ml de un medio de dispersión) del número de células.
- Capacidad para determinar los parámetros de cualquier célula y estructura celular( incluidas las raras).
- Alto grado de objetividad en la medición de la intensidad de luminiscencia( fluorescencia).
¿Dónde presentar la solicitud?
El espectro de aplicación de la citometría de flujo es inusualmente amplio. Se usa incluso en la industria para controlar el proceso de producción. Lo demostraremos proporcionando información en forma de listas para mayor claridad. En oncología
Esta sección medicina citometría de flujo se utiliza para el propósito: análisis cuantitativo
- de estructuras intracelulares( ADN);Estudio
- de los principales parámetros del ciclo celular;
- identificación y recuento de células que pertenecen a diferentes períodos del ciclo celular;
- detección de clones aneuploides( células anormales con conjunto de cromosomas no estándar), indicativos del desarrollo de leucemia aguda;
- que revela el grado de actividad proliferativa( tendencia a la división activa) de los clones aneuploides;
- detección de marcadores tumorales;
- monitoreando el estado de los pacientes en riesgo;
- evalúa el funcionamiento del sistema inmune y la consistencia funcional de las células inmunes;
- la detección de las subpoblaciones de los linfocitos( esta característica permite determinar el estado de la inmunidad).
vídeo de citometría de flujo en el diagnóstico de leucemia aguda:
Inmunología de flujo permite citometría:
- para realizar inmunofenotipo( determinar el tipo y el estado funcional) de las células sanguíneas;
- establecer la actividad fagocítica de las células inmunes( bacterias indicado captura, marcados con colorantes fluorescentes);
- identifica proteínas intracelulares;
- determina el grado de actividad proliferativa;
- para investigar las etapas del ciclo celular;
- evaluar el grado de citotoxicidad( mecanismo de protección para destruir el nivel subcelular a protozoos, bacterias y virus) celular. Citología
citometría de flujo proporciona datos completos a:
- establecer con precisión cytomorphological cualquier características de las células( su tamaño, el nivel de asimetría, la relación entre el núcleo y el citoplasma);
- evalúa la actividad de las enzimas que componen la célula;
- analiza las etapas del ciclo celular;
- medir parámetros fisiológicos intracelulares( nivel de pH, el potencial de la membrana celular, la concentración de iones libres).
Hematología por citometría de flujo puede hematólogos:
- analizar las subpoblaciones de células de la sangre;
- para contar el número de reticulocitos y plaquetas con la ayuda de marcadores específicos;
- evalúa las consecuencias de la enfermedad residual( residual, no completamente curada);
- diagnostica la leucemia aguda;
- realizar una linfocitosis reactiva diagnóstico diferencial y enfermedades linfoproliferativas( enfermedades en las que las células afectadas que tienen naturaleza linfoide);
- para diagnosticar enfermedades de etiología linfoproliferativa.
farmacéuticos
citometría de flujo ayuda a farmacólogos:
- establecer el nivel de expresión( sensibilidad de tumores de diferentes localizaciones fármacos de tratamiento) marcadores de proteínas;
- mide la actividad de las enzimas que componen las células;
- comprometido en el estudio de la acción de sustancias bioactivas en la condición corporal de las células humanas para determinar cualquier fase del ciclo celular.
método agricultura
de citometría de flujo se usa ampliamente por científicos especializados en la cría de nueva reproducción de plantas y animales, ya que le permite:
- determinar la ploidía( número de juegos de cromosomas idénticos en el núcleo) de las células;
- realiza un análisis de cualquier etapa del ciclo celular;
- realizar análisis de contenido de los protoplastos( células bacterianas o de plantas), y clasificación de los producen de acuerdo con parámetros predeterminados.