Kvantitatiivinen sytometriikka on suhteellisen uusi tekniikka dispersioväliaineen mikrobiologiselle tutkimukselle, joka toteutetaan erikoislaitteiden avulla. Sytometriikka on staattinen ja virtaava.
Staattinen sytometriikka suoritetaan konfokaalimikroskoopilla;niiden puuttuessa hieman modifioiduilla luminoivilla mikroskoopilla on yksinkertaiset ja halvat kuvankäsittelyjärjestelmät.
Virtaussytometria suoritetaan erikoislaitteilla, sorter- ja virtausytometrillä.
Molemmilla kvantitatiivisilla sytometrian variantilla on mahdollisimman laaja käyttö lääketieteellisessä ja biologisessa tutkimuksessa. Huolimatta erilaisesta käytetystä kliinisestä materiaalista ja kokeellisista malleista heidän ratkaisemaansa tehtävät ovat tutkimuksen yleisten periaatteiden alaisia.
Mikä on virtaussytometri?
virtaussytometrillä tekniikkaa kutsutaan tutkimus aineiden dispersion tilassa Singler hiukkasten analysoimiseksi, joka käsittää dispergoidun faasin vastaanotettujen signaalien fluoresenssi- ja valon sironta.
Virtaussytometrinen tekniikka kehitettiin erityisten kokeiden perusteella hiukkasten koon määrittämiseksi ja niiden lukumäärän laskemiseksi.
ensimmäinen solu lajittelija luotiin 1965 vuosi, mutta alusta lähtien seuraavan vuosikymmenen järjestettiin tuotanto mittalaitteet fluoresenssivoimakkuudet useamman aallonpituuden määrittämiseksi useita parametreja on tutkittu solu.
tutkijoiden Modern virtaussytometriaa välineitä käytetään kahdenlaisia:
- mittauslaitteet fluoresenssi kaksi( tai enemmän) aallonpituuksilla ja valonsironnan kulmassa kymmenen( ns pienen kulman eteenpäin sironnan) ja yhdeksänkymmentä astetta. Tämän tyyppiset laitteet ovat helppokäyttöisiä.
- Melko raskas solulajittelijä, joka pystyy mittaamaan tutkittavien ytimien tai hiukkasten yli viisi parametria ja myös lajitella soluja, joilla on tietty parametrisarja.
laite kehittynyt virtaussytometrit ovat niin monimutkaisia ja monipuolinen, että se on vaikeaa tahansa yleistys ja systematisoinnista, mutta muutamia yleisiä pistettä, joka on yhteinen kaikille laitteille, on edelleen olemassa:
- varten analyysi sytometrilähde kaikenlaisia edellyttää homogeenisen suspension solujen tietyntyyppisiä.
- Solujen tai niiden ytimien lukumäärän ei pitäisi olla pulaa.
- Jotta solut eivät tartu yhteen, tutkijan on saatava täydelliset tiedot valon hajonnan luonteesta ja oltava taulukoita, joilla on asiaankuuluvat tiedot.
-näytteet
Lääketieteellisten ja biologisten tutkimusten aikana soluista valmistetut näytteet: luuydin
- ;
- -veri;
- aivo-selkäydinneste( CSF);
- synovial( niveltulehdus) -nesteestä;
- pleurausneste;
- -peritoneaalinen( ascites) -fluidi, joka kertyy vatsan onteloon ascitesin kehittymisen aikana;
- kasvain ja terveet kudokset.
Virtaussytometrisen menetelmän periaate
Sytometrisen menettelyn taustalla olevat periaatteet ovat äärimmäisen yksinkertaisia.
suspensiot valmistetaan soluista ennalta leimattu fluoresoivalla monoklonaalisia vasta-aineita tai fluorokromeilla on sijoitettu virtauksen dispersion väliaine, lähetetään virtauskammion läpi. Hydrodynaaminen keskitytään
solususpensiota suihkun virraksi dispersion väliaineen johtaa siihen, että tutkittujen solujen tai niiden tumat on järjestetty yksittäin ja tässä järjestyksessä poikkipalkin keskittynyt valo( tyypillisesti laser) valoa.
Fluorikromien aiheuttama valo fokusoituu optisella järjestelmällä, joka koostuu useista peileistä ja linsseistä ja hajoaa sitten tiettyihin komponentteihin.
Vastaanotetuille valosignaaleille suoritetaan analyysi ja muutos sähköpulsseiksi ja sitten tiettyihin tietojenkäsittelyn ja tallennettavan tiedon hyväksyttäviin muotoihin.
Fluorikromit
Solukkorakenteiden määritysmenetelmän helpottamiseksi virtaussytometrisen menetelmän aikana käytetty dispersioelatusaine sävytetään erityisillä fluoresoivilla väriainefluorikromoilla.
Tällaisen hoidon jälkeen testatut solut hankkivat kyvyn fluoresoida( valoa) valonsäteiden vaikutuksesta.
Väriaineen valintaan käytetään useita kriteerejä:
- Käytetty fluori- kromi on spesifinen tutkittavalle DNA: lle.
- Värin spektriominaisuuksien on vastattava käytettävän laitteen ominaisuuksia.
- Tärkeä tekijä on fluorikromin hinta( sen ei pitäisi olla kovin korkea).
- Käytettävien väriaineiden on oltava helppokäyttöisiä( vakaus ja hyvä liukoisuus).
Yksi suosituimmista fluorikromeista on propidiumjodidi: sen spektriominaisuudet soveltuvat ihanteellisesti virtaussytometrian suorittamiseen.
Fluoresenssin aktivoimiseksi propidiumjodidilla tutkijat turvautuvat perinteiseen argon-laseriin( sen aallonpituus on 480 nm).Fluoresoivan osan pinta-ala on sellainen, että se mahdollistaa edellä mainitun fluorokromin käytön moniparametristen mittausten suorittamiseksi.
Virtaussytometriaan käytetään myös seuraavia:
- -fluoreskeiinisotiosyanaatti;
- -fykoeritriinit( Cy5, Cy7, Texan punainen);
- alloficocyanin;
- Peridinine-klorofylliini.
Riippumatta siitä, mikä väriaine on mukana menetelmässä, sen määrän tulisi olla suoraan verrannollinen solurakenteen DNA: n pitoisuuteen.
Kaikkien solurakenteiden laadullisen värjäämisen aikaansaamiseksi käytetyn fluori- kromin määrän on oltava liiallinen.
Useimmat DNA: n kanssa kosketuksissa olevat fluori- kromit eivät kykene kulkemaan ehjien( ehjien) solujen kalvojen läpi. Solukalvojen läpäisevyyden lisäämiseksi tutkittavat solut käsitellään pinta-aktiivisilla aineilla( detergenteillä) tai alkoholilla.
: n edut Virtausytometrian epäilyttävät edut voidaan harkita:
- High( jopa satatuhatta episodiä sekunnissa) analyysinopeus.
- Kyky määrittää solujen subpopulaatiot.
- Kyky analysoida valtava( enintään 108 elementtiä yhdessä ml: ssa dispergointiväliainetta) solujen lukumäärän perusteella.
- Mahdollisuus määrittää minkä tahansa solun ja solurakenteen( mukaan lukien harvinaiset) parametrit.
- Suuri objektiivisuus luminesenssin voimakkuuden mittauksessa( fluoresenssi).
Mistä hakea?
Virtaussytometrian käyttötaajuus on epätavallisen laaja. Sitä käytetään myös teollisuudessa tuotantoprosessin hallinnassa. Osoitamme tämän tarjoamalla tietoja selkeyden vuoksi luettelojen muodossa.
Onkologiassa
Tässä lääketieteen osassa virtaussytometriaa käytetään:
- kvantifioi solunsisäiset rakenteet( DNA);
- -tutkimus solusyklin pääparametreista;
- solusyklin eri jaksoihin kuuluvien solujen tunnistaminen ja laskeminen;
- : n havaitseminen aneuploidien kloonien( epänormaalit solut, joilla ei-vakio kromosomisarja), jotka osoittavat akuutin leukemian kehittymistä;
- , joka paljastaa aneuploidien kloonien proliferatiivisen aktiivisuuden( pyrkimys aktiiviseen jakautumiseen);
- -tuumorimerkkien havaitseminen;
- valvoa riskialttiiden potilaiden tilaa;
- arvioi immuunijärjestelmän toimintaa ja immuunisolujen toiminnallista yhdenmukaisuutta;
- lymfosyyttien subpopulaatioiden havaitseminen( tämä ominaisuus mahdollistaa koskemattomuuden tilan arvioimisen).
Videota virtaussytometriassa akuutin leukemian diagnoosissa:
Immunologia
Virtaussytometrinen menetelmä mahdollistaa:
- , joka suorittaa verisolujen immunofenotyyppien( määrittää tyypin ja toiminnallisen tilan);
- asettaa fagosytoosiaktiivisuutta immuunisolujen( merkitty bakteerit talteenotto, leimattu fluoresoivia väriaineita);
- tunnistaa solunsisäiset proteiinit;
- määrittää proliferatiivisen aktiivisuuden laajuuden;
- solusyklin vaiheiden tutkimiseksi;
- asteen arvioimiseksi sytotoksisuuden( suojamekanismi tuhota subsellulaarisen tason alkueläimet, bakteerit ja virukset) solu. Sytologia
Virtaussytometriaa tarjoaa kattavan datan:
- asettaa tarkasti cytomorphological tahansa solujen ominaisuudet( sen koosta, taso epäsymmetria, välinen suhde ytimen ja sytoplasman);
- arvioi solun muodostavien entsyymien aktiivisuutta;
- analysoi solusyklin vaiheet;
- mittaa fysiologisia solunsisäisiä parametreja( pH-arvo, solumembraanipotentiaali, vapaiden ionien konsentraatio).
Hematologia virtaussytometrialla voi Hematologia:
- analysoida verisolujen alapopulaatiot;
- laskee retikulosyyttien ja verihiutaleiden määrän spesifisten markkereiden avulla;
- arvioi jäljellä olevan( jäljellä olevan, ei täysin parantuneen) taudin seuraukset;
- diagnosoi akuutti leukemia;
- suorittaa erotusdiagnoosissa reaktiivinen lymfosytoosia ja lymfoproliferatiiviset sairaudet( sairauksia, joissa vaikuttavat solut, joilla lymfoidi- luonne);
- lymfoproliferatiivisen etiologian sairauksien diagnosoimiseksi.
Pharmaceuticals
Virtaussytometriaa auttaa farmakologian:
- set ekspressiotaso( herkkyys kasvainten eri lokalisointi hoito lääkkeet) proteiini-markkerit;
- mittaa entsyymien aktiivisuutta, jotka muodostavat solut;
- harjoittavat tutkimalla toimia bioaktiivisten aineiden kehon kunnossa ihmisen solujen määrittävät kaikki solukiertovaiheesta.
maatalous
menetelmä virtaussytometria on laajasti käytössä tiedemiehet erikoistunut jalostukseen uusien kasvien ja eläinten jalostaminen, koska sen avulla voit:
- selvittää ploidisuus( määrä identtisiä kromosomin sarjaa tumassa) solut;
- suorittaa solun syklin vaiheen analyysin;
- suorittaa protoplastien( bakteeri- tai kasvisolujen) sisällön analyysin ja lajittelee ne asetettujen parametrien mukaan.