La cytométrie quantitative est une technique relativement nouvelle pour l'étude microbiologique des milieux de dispersion, réalisée à l'aide d'un équipement spécial. La cytométrie est statique et fluide.
La cytométrie statique est réalisée à l'aide de microscopes confocaux;en l'absence de ceux-ci, les microscopes luminescents légèrement modifiés sont équipés de systèmes d'analyse d'images simples et bon marché.
La cytométrie de flux est réalisée sur des dispositifs spéciaux - trieurs et cytromètres de flux.
Les deux variantes de la cytométrie quantitative ont l'application la plus large possible dans la pratique de la recherche médicale et biologique. Malgré la différence entre le matériel clinique utilisé et les modèles expérimentaux, les tâches qu'ils résolvent sont soumises aux principes généraux de l'étude.
Qu'est-ce que la cytométrie en flux?
cytométrie de flux des substances à l'étude appelée technique dans le mode de dispersion individualiseur analyse des particules comprenant la phase dispersée de signaux reçus au niveau de la diffusion de la fluorescence et la lumière.
La technique de cytométrie en flux a été développée sur la base d'expériences spéciales pour déterminer la taille des particules étudiées et compter leur nombre.
premier trieur de cellules a été créée en 1965 année, mais depuis le début de la prochaine décennie a été la production de dispositifs pour arrangé mesurer l'intensité de fluorescence à plusieurs longueurs d'onde pour déterminer plusieurs paramètres de la cellule étudiée.
pour les chercheurs flux moderne cytométrie instruments sont utilisés deux types:
- Instruments de mesure de fluorescence à deux( ou plus) des longueurs d'onde et diffusion de la lumière à un angle de dix( la soi-disant petits angles de diffusion vers l'avant) et quatre-vingt dix degrés. Les appareils de ce type sont faciles à utiliser.
- Jolis trieuses de cellules encombrantes qui peuvent mesurer plus de cinq paramètres des noyaux ou des particules étudiés, et trient également les cellules qui ont un certain ensemble de paramètres.cytomètres de dispositif
de flux avancés sont si complexes et diverses qu'il est difficile de toute généralisation et la systématisation, mais quelques points généraux, communs à tous les appareils, existe toujours:
- Pour une analyse sur le cytomètre de tout type nécessite une suspension homogène de cellules d'un certain type.
- Il ne devrait pas y avoir de pénurie du nombre de cellules ou de leurs noyaux.
- Pour empêcher les cellules de coller ensemble, le chercheur doit avoir des informations complètes sur la nature de la diffusion de la lumière et avoir des tableaux avec des données pertinentes à portée de main.
Samples
Au cours d'études médicales et biologiques, des échantillons préparés à partir de cellules:
- de la moelle osseuse;
- sang;
- liquide céphalorachidien( LCR);
- du liquide synovial( articulaire);
- liquide pleural;
- liquide péritonéal( ascite) s'accumulant dans la cavité abdominale au cours du développement de l'ascite;
- de la tumeur et des tissus sains.
Principe de la méthode de cytométrie en flux
Les principes qui sous-tendent la procédure cytométrique sont extrêmement simples.
Une suspension préparée à partir de cellules préalablement marquées avec des anticorps monoclonaux fluorescents ou des fluorochromes est placée dans un flux de milieu de dispersion traversant une cellule d'écoulement. Focalisation hydrodynamique jet de suspension de cellules
dans un courant du milieu de dispersion conduit au fait que les cellules étudiées ou leurs noyaux sont disposés séparément et dans cet ordre poutre transversale focalisés de lumière( typiquement laser) de lumière.
lumière provenant de fluorochromes, focalisé par un système optique composé de plusieurs miroirs et les lentilles, puis étalées sur certains composants.
Les signaux lumineux reçus sont soumis à l'analyse et à la transformation en impulsions électriques, puis à certaines formes acceptables pour le traitement informatique et le stockage des informations reçues.
Fluorochromes
Afin de faciliter le processus de détermination des structures cellulaires au cours de la procédure de cytométrie en flux, le milieu de dispersion utilisé est teinté avec des colorants fluorescents spéciaux fluorochromes.
Après un tel traitement, les cellules testées acquièrent la capacité de fluorescer( la lumière) sous l'influence d'un faisceau de rayons lumineux.
Lors du choix d'un colorant, un certain nombre de critères sont utilisés:
- Le fluorochrome utilisé doit être spécifique de l'ADN étudié.
- Les caractéristiques spectrales du colorant doivent correspondre aux capacités de l'équipement utilisé.
- Un facteur important est le coût du fluorochrome( il ne devrait pas être très élevé).
- Les colorants utilisés doivent être faciles à utiliser( avoir une stabilité et une bonne solubilité).
L'un des fluorochromes les plus populaires est l'iodure de propidium: ses caractéristiques spectrales sont idéales pour la cytométrie de flux.
Pour activer la fluorescence en utilisant l'iodure de propidium, les chercheurs ont recours à un laser argon conventionnel( sa longueur d'onde de travail est de 480 nm).La zone de la section fluorescente est telle qu'elle nous permet d'utiliser le fluorochrome mentionné ci-dessus pour effectuer des mesures multiparamètres.
Pour la cytométrie en flux, on utilise également:
- isothiocyanate de fluorescéine;Phycoérythrine
- ( Cy5, Cy7, rouge texan);
- alloficocyanine;
- Protéine péridinine-chlorophylle.
Quel que soit le colorant impliqué dans la procédure, sa quantité doit être directement proportionnelle à la teneur en ADN de la structure cellulaire.
Afin d'obtenir une coloration qualitative de toutes les structures cellulaires, la quantité de fluorochrome utilisée doit être excessive.
La plupart des fluorochromes entrant en contact avec l'ADN ne peuvent pas traverser les membranes des cellules intactes( intactes).Pour augmenter la perméabilité des membranes cellulaires, les cellules étudiées sont traitées avec des tensioactifs( détergents) ou avec de l'alcool.
Avantages de
Les avantages incontestables de la cytométrie en flux peuvent être considérés:
- Vitesse d'analyse élevée( jusqu'à 100 000 épisodes par seconde).
- Capacité à déterminer des sous-populations cellulaires.
- La capacité à effectuer l'analyse d'un énorme( jusqu'à 108 éléments dans un ml d'un milieu de dispersion) du nombre de cellules.
- Capacité à déterminer les paramètres de toutes les cellules et structures cellulaires( y compris les rares).
- Haut degré d'objectivité dans la mesure de l'intensité de la luminescence( fluorescence).
Où postuler?
Le spectre d'application de la cytométrie en flux est inhabituellement large. Il est utilisé même dans l'industrie pour contrôler le processus de production. Nous allons le démontrer en fournissant des informations sous forme de listes pour plus de clarté.
En oncologie
Dans cette section de la médecine, la cytométrie en flux est utilisée pour:
- quantifier les structures intracellulaires( ADN);
- étude des principaux paramètres du cycle cellulaire;
- identification et comptage de cellules appartenant à différentes périodes du cycle cellulaire;Détection
- de clones aneuploïdes( cellules anormales avec un ensemble chromosomique non standard), indiquant le développement d'une leucémie aiguë;
- révélant le degré d'activité proliférative( tendance à la division active) des clones aneuploïdes;
- détection des marqueurs tumoraux;
- suivi de l'état des patients à risque;
- évalue le fonctionnement du système immunitaire et la cohérence fonctionnelle des cellules immunitaires;
- détection de sous-populations de lymphocytes( cette caractéristique permet d'évaluer l'état de l'immunité).
Vidéo sur la cytométrie en flux dans le diagnostic de la leucémie aiguë:
Immunologie
La méthode de cytométrie en flux permet:
- pour effectuer l'immunophénotypage( déterminer le type et l'état fonctionnel) des cellules sanguines;
- établir l'activité phagocytaire des cellules immunitaires( ceci est indiqué par la capture de bactéries marquées avec des colorants fluorescents);
- identifier les protéines intracellulaires;
- déterminer l'étendue de l'activité proliférative;
- pour étudier les étapes du cycle cellulaire;
- évaluer le degré de cytotoxicité( mécanisme de protection pour détruire le niveau subcellulaire de protozoaires, bactéries et virus) cellule. Cytologie
flux fournit cytométrie de données complètes à:
- définir avec précision les caractéristiques cytomorphologique de cellules( sa taille, le niveau d'asymétrie, le rapport entre le noyau et le cytoplasme);
- évaluer l'activité des enzymes qui composent la cellule;
- analyse les étapes du cycle cellulaire;
- mesure les paramètres physiologiques intracellulaires( niveau de pH, potentiel de membrane cellulaire, concentration d'ions libres).
Hématologie par cytométrie en flux peut hématologues:
- analyser les sous-populations de cellules sanguines;
- pour compter le nombre de réticulocytes et de plaquettes à l'aide de marqueurs spécifiques;
- évalue les conséquences de la maladie résiduelle( résiduelle, pas complètement cicatrisée);
- diagnostiquer une leucémie aiguë;
- effectuent des diagnostics différentiels de la lymphocytose réactive et des maladies lymphoprolifératives( maladies dans lesquelles les cellules de nature lymphoïde sont affectées);
- pour diagnostiquer les maladies de l'étiologie lymphoproliférative.
Pharmaceuticals cytométrie de flux
aide pharmacologues:
- régler le niveau d'expression( sensibilité des tumeurs de différentes localisations de médicaments de traitement) des marqueurs protéiques;
- mesure l'activité des enzymes qui composent les cellules;
- engagé dans l'étude de l'action des substances bioactives sur l'état des cellules du corps humain, afin de déterminer toute étape du cycle cellulaire.
méthode agriculture
de cytométrie en flux est largement utilisé par les scientifiques spécialisés dans l'élevage de nouvelles sélection végétale et animale, car il vous permet de: déterminer
- ploïdie( nombre d'ensembles de chromosomes identiques dans le noyau) cellules;
- effectuer une analyse de n'importe quelle étape du cycle cellulaire;
- effectue l'analyse du contenu des protoplastes( cellules bactériennes ou végétales) et les trient en fonction des paramètres définis.