La citometria quantitativa è una tecnica relativamente nuova per l'analisi microbiologica dei mezzi di dispersione, eseguita con l'ausilio di attrezzature speciali. La citometria è statica e fluente.
La citometria statica viene eseguita mediante microscopi confocali;in assenza di questi, i microscopi luminescenti leggermente modificati sono dotati di sistemi di analisi delle immagini semplici ed economici.
La citometria a flusso viene eseguita su dispositivi speciali - sorter e citometri a flusso.
Entrambe le varianti di citometria quantitativa hanno la più ampia applicazione possibile nella pratica della ricerca medica e biologica. Nonostante la differenza nel materiale clinico utilizzato e nei modelli sperimentali, i compiti che risolvono sono soggetti ai principi generali dello studio.
Cos'è la citometria a flusso?flusso
citometria tecnica chiamata sostanze studio nel Singler modalità dispersione analizzando particelle comprendenti la fase dispersa di segnali ricevuti a fluorescenza e di dispersione della luce.
La tecnica della citometria a flusso è stata sviluppata sulla base di esperimenti speciali per determinare le dimensioni delle particelle in studio e contare il loro numero.
prima cell sorter è stato creato nel 1965 anno, ma dall'inizio del prossimo decennio è stato organizzato produzione di dispositivi per la misurazione di intensità di fluorescenza a diverse lunghezze d'onda per determinare più parametri della cellula studiata.
per i ricercatori flusso moderna citometria strumenti sono utilizzati due tipi:
- Dispositivi di misurazione della fluorescenza a due( o più) lunghezze d'onda e diffusione di luce ad un angolo di dieci( cosiddetta piccolo angolo di dispersione in avanti) e novanta gradi. Dispositivi di questo tipo sono facili da usare.
- Selezionatori di celle piuttosto ingombranti che possono misurare più di cinque parametri dei nuclei o delle particelle indagati e anche ordinare le celle che hanno un determinato insieme di parametri.dispositivo
avanzata citometri a flusso sono così complessi e diversificata che è difficile a qualsiasi generalizzazione e sistemazione, ma alcuni punti generali, comune a tutti i dispositivi, esiste ancora:
- Per analisi sul citometro di qualsiasi tipo richiede una sospensione omogenea delle cellule di un certo tipo.
- Non ci dovrebbe essere carenza del numero di cellule o dei loro nuclei.
- Per evitare che le celle si uniscano, il ricercatore deve avere informazioni complete sulla natura della dispersione della luce e disporre di tabelle con i dati pertinenti a portata di mano.
Campioni
Durante studi medici e biologici, campioni preparati da cellule:
- di midollo osseo;
- sangue;
- liquido cerebrospinale( CSF);
- del liquido sinoviale( articolare);
- fluido pleurico;
- liquido peritoneale( ascite) che si accumula nella cavità addominale durante lo sviluppo di ascite;
- di tumore e tessuti sani.
Principio del metodo di citometria a flusso
I principi alla base della procedura citometrica sono estremamente semplici.sospensioni
preparati da cellule pre-marcate con anticorpi monoclonali fluorescenti o fluorocromi vengono inseriti nel flusso del mezzo di dispersione, trasmessa attraverso la cella di flusso. Focalizzazione idrodinamica jet sospensione cellulare
in un flusso del mezzo di dispersione porta al fatto che le cellule indagato oi loro nuclei sono disposti singolarmente e in questo ordine traversa concentrati di luce( tipicamente laser) luce.
La luce emessa dai fluorocromi viene focalizzata mediante un sistema ottico costituito da diversi specchi e lenti e quindi scomposta in componenti specifici.
I segnali luminosi ricevuti sono sottoposti ad analisi e trasformazione in impulsi elettrici e quindi a determinate forme accettabili per l'elaborazione e la memorizzazione del computer delle informazioni ricevute.
Fluorocromi
Al fine di facilitare il processo di determinazione delle strutture cellulari durante la procedura di citometria a flusso, il mezzo di dispersione utilizzato è colorato con coloranti fluorescenti speciali fluorocromi.
Dopo tale trattamento, le cellule sotto test acquisiscono la capacità di fluorescenza( leggera) sotto l'influenza di un raggio di raggi luminosi.
Quando si sceglie un colorante, vengono utilizzati una serie di criteri:
- Il fluorocromo utilizzato deve essere specifico per il DNA in esame.
- Le caratteristiche spettrali del colorante devono corrispondere alle capacità dell'apparecchiatura utilizzata.
- Un fattore importante è il costo del fluorocromo( non dovrebbe essere molto alto).
- I coloranti utilizzati devono essere facili da usare( avere stabilità e buona solubilità).
Uno dei più popolari fluorocromi è lo ioduro di propidio: le sue caratteristiche spettrali sono ideali per l'esecuzione della citometria a flusso.
Per attivare la fluorescenza utilizzando ioduro di propidio, i ricercatori ricorrono a un laser ad argon convenzionale( la lunghezza d'onda di lavoro è 480 nm).L'area della sezione fluorescente è tale da consentirci di utilizzare il fluorocromo sopra menzionato per eseguire misurazioni multiparametriche.
Per la citometria a flusso si usa anche: isotiocianato di fluoresceina
- ;Ficoeritrine
- ( Cy5, Cy7, rosso texano);
- alloficocianina;
- Proteina peridinina-clorofilla.
Indipendentemente dal colorante coinvolto nella procedura, la sua quantità deve essere direttamente proporzionale al contenuto di DNA nella struttura cellulare.
Al fine di ottenere una colorazione qualitativa di tutte le strutture cellulari, la quantità di fluorocromo utilizzata deve essere eccessiva.
La maggior parte dei fluorocromi che entrano in contatto con il DNA non sono in grado di passare attraverso le membrane delle cellule intatte( intatte).Per aumentare la permeabilità delle membrane cellulari, le cellule in esame sono trattate con tensioattivi( detergenti) o con alcool. Vantaggi
di
I vantaggi indiscussi della citometria a flusso possono essere considerati: velocità di analisi
- alta( fino a centomila episodi al secondo).
- Capacità di determinare sottopopolazioni cellulari.
- La capacità di eseguire analisi di un enorme( fino a 108 elementi in un ml di un mezzo di dispersione) del numero di celle.
- Capacità di determinare i parametri di eventuali cellule e strutture cellulari( comprese quelle rare).
- Alto grado di obiettività nella misurazione dell'intensità della luminescenza( fluorescenza).
Dove candidarsi?
Lo spettro di applicazione della citometria a flusso è insolitamente ampio. Viene utilizzato anche nell'industria per controllare il processo di produzione. Lo dimostreremo fornendo informazioni sotto forma di elenchi di chiarezza.
In oncologia
In questa sezione di medicina, la citometria a flusso è utilizzata per:
- quantificare le strutture intracellulari( DNA);Studio
- dei principali parametri del ciclo cellulare;
- identificazione e conteggio di cellule appartenenti a diversi periodi del ciclo cellulare;
- rilevamento di cloni aneuploidi( cellule anomale con set cromosomico non standard), indicativo dello sviluppo della leucemia acuta;
- che rivela il grado di attività proliferativa( tendenza alla divisione attiva) dei cloni aneuploidi;Rilevamento
- dei marcatori tumorali;
- che monitora lo stato dei pazienti a rischio;
- valuta il funzionamento del sistema immunitario e la consistenza funzionale delle cellule immunitarie;Rilevazione
- di sottopopolazioni di linfociti( questa caratteristica consente di valutare lo stato di immunità).
Video sulla citometria a flusso nella diagnosi di leucemia acuta:
Immunologia
Il metodo di citometria a flusso consente:
- per eseguire immunofenotipizzazione( determinare il tipo e lo stato funzionale) delle cellule del sangue;
- set fagocitaria delle cellule immunitarie( cattura batteri indicato, marcati con coloranti fluorescenti);
- identifica le proteine intracellulari;
- determina l'estensione dell'attività proliferativa;
- per indagare le fasi del ciclo cellulare;
- valutare il grado di citotossicità( meccanismo di protezione per distruggere il livello subcellulare di protozoi, batteri e virus) cellule. Citologia
flusso fornisce dati completi citometria a:
- accuratamente impostare citomorfologici eventuali caratteristiche cellulari( le sue dimensioni, il livello di asimmetria, il rapporto tra nucleo e nel citoplasma);
- valuta l'attività degli enzimi che compongono la cellula;
- analizza le fasi del ciclo cellulare;
- misura i parametri fisiologici intracellulari( livello di pH, potenziale della membrana cellulare, concentrazione di ioni liberi).
Ematologia mediante citometria di flusso può ematologi:
- analizzare le sottopopolazioni di cellule del sangue;
- per contare il numero di reticolociti e piastrine con l'aiuto di specifici marcatori;
- valuta le conseguenze della malattia residua( residua, non completamente guarita);
- diagnosticare la leucemia acuta;
- eseguire una diagnosi differenziale linfocitosi reattiva e malattie linfoproliferative( malattie in cui le cellule colpite aventi natura linfoide);
- per diagnosticare malattie di eziologia linfoproliferativa.
Pharmaceuticals
flusso aiuta citometria farmacologi:
- impostare il livello di espressione( sensibilità dei tumori di diverse localizzazioni farmaci trattamento) marcatori proteici;
- misura l'attività degli enzimi che compongono le cellule;
- impegnato a studiare l'azione di sostanze bioattive nella condizione corporea delle cellule umane per determinare qualsiasi fase del ciclo cellulare.
metodo di agricoltura
di citometria a flusso è ampiamente utilizzato dagli scienziati specializzati nell'allevamento di nuova selezione delle piante e degli animali, in quanto consente di:
- determinare ploidia( numero di set di cromosomi identici nel nucleo) le cellule;
- esegue un'analisi di qualsiasi fase del ciclo cellulare;
- eseguire analisi del contenuto di protoplasti( cellule batteriche o vegetali), e smistamento produrli secondo parametri prestabiliti.