Kvantitativna citometrija je sorazmerno nova tehnika mikrobiološke preiskave disperzijskih medijev, izvedena s pomočjo posebne opreme. Citometrija je statična in tekoča.
Statična citometrija se izvaja z uporabo konfokalnih mikroskopov;če jih ni, so nekoliko spremenjeni luminescentni mikroskopi opremljeni s preprostimi in poceni sistemi za analizo slike.
Pretočna citometrija se izvaja na posebnih napravah - sorterjev in pretočnih citometrov.
Obe različici kvantitativne citometrije imajo čim širšo uporabo v praksi medicinskih in bioloških raziskav. Kljub različnosti uporabljenega kliničnega gradiva in eksperimentalnih modelov naloge, ki jih rešujejo, so predmet splošnih načel študije.
Kaj je pretočna citometrija?
za pretočno citometrijo tehniko, imenovano študijske snovi v načinu disperzija singler analiznega delce, ki obsegajo razpršeno fazo signalov prispela na fluorescence in sipanja svetlobe.
Tehnika pretočne citometrije je bila razvita na podlagi posebnih eksperimentov, da bi določili velikost delcev, ki jih preučujemo, in štetje njihovega števila.
prvi mobilni sorter je bila ustanovljena leta 1965 leta, vendar že od začetka naslednjega desetletja je bil urejen proizvodnjo naprav za merjenje intenzivnosti fluorescence pri različnih valovnih dolžinah, da določi več parametrov obravnavanega celice.
za raziskovalce sodobne pretočno citometrijo instrumentov uporabljamo dve vrsti:
- Instrumenti za merjenje fluorescence na dveh( ali več) valovnih dolžinah in sipanja svetlobe pod kotom desetih( tako imenovani mali kotom naprej sipanje) in devetdeset stopinj. Naprave te vrste so enostavne za uporabo.
- Precej okornih celičnih sorterjev, ki lahko merijo več kot pet parametrov raziskanih jeder ali delcev, pa tudi sortirajo celice, ki imajo določen niz parametrov.
naprave napredne cytometers tokov so tako kompleksna in raznolika, da je težko za vse posploševanja in sistemizaciji, vendar pa je nekaj splošnih točk, skupno na vseh napravah, še vedno obstaja:
- Za analizo o citometru katere koli vrste zahteva homogeno suspenzijo celic določenega tipa.
- Ne sme biti pomanjkanja števila celic ali njihovih jeder.
- Da bi preprečili, da se celice držijo skupaj, mora raziskovalec imeti popolne informacije o naravi razprševanja svetlobe in imeti na voljo preglednice z ustreznimi podatki.
Vzorci
Med medicinskimi in biološkimi študijami so bili vzorci pripravljeni iz celic:
- kostnega mozga;
- kri;
- cerebrospinalna tekočina( CSF);
- sinovialne( artikularne) tekočine;
- pleuralna tekočina;
- peritonealna tekočina( ascites), ki se kopiči v trebušni votlini med razvojem ascitesa;
- tumorja in zdravih tkiv.
Načelo metoda tokovne citometrije
Principi, na katerih temelji citometrični postopek, so zelo enostavni.suspenzije
pripravljene iz celic predhodno označenih s fluorescentnimi monoklonskimi protitelesi ali fluorokromi se nahaja v toku disperzni medij, prepuščena skozi pretočno celico. Hidrodinamični usmerimo
celični suspenziji curka v toku disperzni medij vodi k dejstvu, da so preiskovane celice ali njihovi jedra razporejeni posamezno in v tem vrstnem redu predložek snopa usmerjena svetlobo( tipično lasersko) svetlobe.
Svetloba, ki izhaja iz fluorokromov, je osredotočena z optičnim sistemom, sestavljenim iz več ogledal in leč, nato pa se razgradi v določene komponente.
Prejeti svetlobni signali se analizirajo in pretvarjajo v električne impulze, nato pa v določene oblike, sprejemljive za računalniško obdelavo in shranjevanje prejetih informacij.
Fluorochromes
Da bi olajšali postopek določanja celičnih struktur med postopkom pretočne citometrije, je uporabljen disperzijski medij niansiran s posebnimi fluorescenčnimi barvami-fluorokromi.
Po taki obdelavi testne celice pridobijo sposobnost fluorescence( svetlobe) pod vplivom žarka svetlobe.
Pri izbiri barve se uporabljajo številna merila:
- Uporabljeni fluorokrom mora biti specifičen za preiskovano DNK.
- Spektralne lastnosti barvila morajo ustrezati zmogljivostim uporabljene opreme.
- Pomemben dejavnik so stroški fluorochroma( ne sme biti zelo visok).
- Uporabljene barve morajo biti enostavne za uporabo( imajo stabilnost in dobro topnost).
Eden izmed najbolj priljubljenih fluorokromov je propidijev jodid: njegove spektralne lastnosti so idealne za izvajanje pretočne citometrije.
Za aktiviranje fluorescence z uporabo propidijevega jodida raziskovalci uporabljajo konvencionalni laser argona( njegova delovna valovna dolžina je 480 nm).Področje fluorescenčnega odseka je tako, da omogoča uporabo zgoraj omenjenega fluorochroma za izvajanje večparametrskih meritev.
Za pretočno citometrijo se uporablja tudi:
- fluorescein izotiocianat;
- phycoerythrins( Cy5, Cy7, Texan rdeče);
- alofikocianin;
- Peridinin-klorofil protein.
Ne glede na to, katero barvilo je vključeno v postopek, mora biti njegova količina neposredno sorazmerna z vsebnostjo DNK v celični strukturi.
Da bi dosegli kakovostno obarvanje vseh celičnih struktur, mora biti količina uporabljenega fluorokoma pretirana.
Večina fluorohromov, ki prihajajo v stik z DNA, ne morejo skozi membrane nedotaknjenih celic. Da bi povečali prepustnost celičnih membran, se celice, ki se preiskujejo, zdravijo s površinsko aktivnimi sredstvi( detergenti) ali z alkoholom.
Prednosti
nedvomno, se lahko šteje prednosti pretočno citometrijo:
- visoka( do enega sto tisoč epizod na sekundo), hitrost analize.
- Sposobnost določanja celičnih subpopulacij.
- Sposobnost izvajanja analize velikosti( do 108 elementov v enem ml disperzijskega medija) števila celic.
- Sposobnost določanja parametrov vseh celic in celičnih struktur( vključno z redkimi).
- Visoka stopnja objektivnosti pri merjenju intenzitete svetlosti( fluorescenca).
Kje se prijaviti?
Spekter uporabe pretočne citometrije je nenavadno širok. Uporablja se tudi v industriji za nadzor proizvodnega procesa. To bomo prikazali z zagotavljanjem informacij v obliki seznama za jasnost.
V onkologiji
V tem oddelku medicine se uporablja pretočna citometrija za:
- kvantificira intracelularne strukture( DNA);
- študija glavnih parametrov celičnega cikla;
- identifikacija in štetje celic, ki pripadajo različnim obdobjem celičnega cikla;
- odkrivanje aneuploidnih klonov( nenormalnih celic z nestandardnim setom kromosomov), kar kaže na razvoj akutne levkemije;
- , ki razkriva stopnjo proliferativne aktivnosti( težnja po aktivnem deljenju) aneuploidnih klonov;
- odkrivanje tumorskih markerjev;
- spremlja stanje ogroženih pacientov;
- ocenjuje delovanje imunskega sistema in funkcionalno doslednost imunskih celic;
- odkrivanje subpopulacij limfocitov( ta značilnost omogoča oceno stanja imunosti).
Video pretočnim citometrom v diagnozi akutne levkemije:
imunologijo Flow citometrijo omogoča:
- za izvajanje imunofenotipa( določi vrsto in funkcionalno stanje) krvnih celic;
- določeno fagocitna aktivnost imunskih celic( naveden bakterij zajem, označenih s fluorescentnimi barvili);
- ugotavlja intracelularne beljakovine;
- določi obseg proliferativne aktivnosti;
- za raziskovanje stopenj celičnega cikla;
- oceno stopnje citotoksičnosti( zaščitnega mehanizma, da se uniči subceličnih nivo na protozojske, bakterij in virusov) celice. Citologija
pretočno citometrijo zagotavlja celovite podatke:
- natančno določen cytomorphological vseh značilnosti celic( njegova velikost, stopnja asimetrije, razmerje med jedrom in citoplazmo);
- oceni aktivnost encimov, ki tvorijo celico;
- analizira stopnje celičnega cikla;
- merjenje znotrajcelične fizioloških parametrov( vrednost pH, potencial celične membrane, koncentracija prostih ionov).
Hematologija s pretočno citometrijo lahko Hematološke:
- analizirali podpopulacije krvnih celic;
- za štetje števila retikulocitov in trombocitov s pomočjo posebnih markerjev;
- oceni posledice preostale( ostanke, ki niso popolnoma zaceljene) bolezni;
- diagnosticira akutno levkemijo;
- opraviti diferencialno diagnozo reaktivno limfocitozo in limfoproliferativne bolezni( bolezni, pri katerih so bile prizadete celice imajo limfoidnega naravo);
- za diagnosticiranje bolezni limfoproliferativne etiologije.
Farmacevtski
pretočno citometrijo pomaga Farmakologa:
- določi nivo ekspresije( občutljivost tumorji različnih lokalizacije droge zdravilne učinkovine) proteinskih označevalcev;
- meri aktivnost encimov, ki tvorijo celice;
- ukvarja s preučevanjem delovanja bioaktivnih snovi v stanju človeških celicah telesa ugotoviti vse faze celičnega ciklusa.
metoda kmetijstvo
za pretočno citometrijo se znanstveniki so specializirane za vzrejo novih rastlin in živali, vzrejo pogosto uporablja, saj vam na omogoča:
- ugotoviti ploidije( število enakih kromosomskih garnitur v jedru) celice;
- izvede analizo katerekoli stopnje celičnega cikla;
- izvedbo analize vsebine iz protoplastov( bakterijske ali rastlinskih celicah) in sortiranje njihovo proizvodnjo v skladu z vnaprej določenimi parametri.