Kvantitativ cytometri er en relativt ny teknikk for mikrobiologisk undersøkelse av dispersjonsmedier, utført ved hjelp av spesialutstyr. Cytometri er statisk og flytende.
Statisk cytometri utføres ved hjelp av konfokale mikroskoper;I fravær av dem er litt modifiserte luminescerende mikroskoper utstyrt med enkle og billige bildeanalysesystemer.
Flowcytometri utføres på spesielle enheter - sorter og flow-cytrometre.
Begge variantene av kvantitativ cytometri har bredest mulig anvendelse i utøvelse av medisinsk og biologisk forskning. Til tross for forskjellen i det anvendte kliniske materialet og de eksperimentelle modellene, er oppgavene de løser underlagt de generelle prinsippene i studien.
Hva er flowcytometri?
flowcytometri teknikk som kalles studie stoffer i dispersjonen modus singler analyserer partikler som omfatter den dispergerte fasen av signaler som mottas ved fluorescens og lysspredning.
Flowcytometri teknikken ble utviklet på grunnlag av spesielle eksperimenter for å bestemme størrelsen på partiklene under studien og telle tallet deres.
første cellesorterer ble opprettet i 1965 år, men siden begynnelsen av det neste tiåret ble arrangert produksjon av anordninger for måling av fluorescens intensitet på flere bølgelengder for å bestemme flere parametere av de studerte cellen.
for forskere Modern flowcytometri instrumenter benyttes to typer:
- Instrumenter for måling av fluorescens ved to( eller flere) bølgelengder og lysspredning i en vinkel på ti( den såkalte liten vinkel forover spredning) og nitti grader. Enheter av denne type er enkle å bruke.
- Ganske besværlige cellesortere som kan måle mer enn fem parametere av de undersøkte kjerne eller partikler, og også sortere celler som har et bestemt sett med parametere.
enhets avanserte flowcytometere er så komplisert og mangfoldig at det er vanskelig å en hvilken som helst generalisering og systematisering, men noen generelle punkter, som er felles for alle anordninger, eksisterer fortsatt:
- For analyse på cytometer av enhver type krever en homogen suspensjon av celler av en viss type.
- Det bør ikke være mangel på antall celler eller deres kjerner.
- For å forhindre at cellene stikker sammen, må forskeren ha full informasjon om typen av lysets spredning og ha tabeller med relevante data ved hånden.
Prøver
Under medisinske og biologiske studier ble prøver fremstilt fra celler:
- av benmarg;
- blod;
- cerebrospinalvæske( CSF);
- av synovial( artikulær) væske;
- pleural fluid;
- peritoneal( ascites) væske som akkumuleres i bukhulen under utviklingen av ascites;
- av svulst og sunt vev.
Prinsipp for strømningscytometrimetoden
Prinsippene som ligger bak den cytometriske prosedyren er ekstremt enkle.
suspensjoner fremstilt fra celler pre-merket med fluorescente, monoklonale antistoffer eller fluorokromer er plassert i strømmen av dispersjonsmediet, overføres gjennom strømningscellen. Hydrodynamisk fokusering
cellesuspensjonsstråle inn i en strøm av dispersjonsmediet fører til det faktum at de undersøkte cellene eller deres kjerner er anordnet enkeltvis og i denne rekkefølge tverrbjelke fokuserte lyset( typisk laser) lys.
Lyset som kommer fra fluorokromene, er fokusert ved hjelp av et optisk system bestående av flere speil og linser, og deretter dekomponeres i bestemte komponenter.
De mottatte lyssignaler underkastes analyse og transformasjon i elektriske pulser, og deretter til bestemte former som er akseptable for databehandling og lagring av mottatt informasjon.
Fluorokrom
For å forenkle prosessen med å bestemme cellestrukturer i flowcytometri fremgangsmåter som anvendes dispersjonsmediet farget med et fluoriserende fargestoff - fluorokromer.
Etter en slik behandling, får de testede cellene evnen til å fluorescere( lys) under påvirkning av en stråle av lysstråler.
Ved valg av et fargestoff som brukes ved en rekke kriterier:
- fluorokrom som brukes skal være spesifikk for mål-DNA.
- Fargestoffets spektrale egenskaper må samsvare med evnen til utstyret som brukes.
- En viktig faktor er kostnaden for fluorokrom( den bør ikke være veldig høy).
- De anvendte fargestoffene skal være enkle å bruke( ha stabilitet og god oppløselighet).
En av de mest populære fluorokromene er propidiumjodid: dets spektrale egenskaper er ideelle for å utføre flytcytometri. For å aktivere
fluorescens ved anvendelse av propidiumjodid, forskere har tydd til anvendelse av en konvensjonell argon-laser( som opererer dens bølgelengde er 480 nm).Arealet av fluorescerende seksjonen er slik at det tillater oss å bruke ovennevnte fluorokrom til å utføre flerparametermålinger.
For flytcytometri brukes følgende også:
- fluorescein isothiocyanate;
- phycoerythrins( Cy5, Cy7, Texan red);
- alloficocyanin;
- peridinin-klorofyllprotein.
Uansett hvilken fargestoff som er involvert i prosedyren, bør mengden være direkte proporsjonal med innholdet av DNA i cellestrukturen.
For å oppnå kvalitativ farging av alle cellulære strukturer må mengden fluorokrom som brukes, være overdreven.
De fleste fluorokrom som kommer i kontakt med DNA, er ikke i stand til å passere gjennom membranene i intakt( intakt) celler. For å øke permeabiliteten av cellemembraner, behandles celler som undersøkes med overflateaktive midler( vaskemidler) eller med alkohol.
Fordeler
utvilsom fordeler ved flowcytometri kan betraktes:
- høy( opp til ett hundre tusen episoder per sekund) hastighet analyse.
- Evne til å bestemme cellesubpopulasjoner.
- Evnen til å utføre analyse av en stor( opptil 108 elementer i en ml av et dispersjonsmedium) av antall celler.
- Evne til å bestemme parametrene til noen celler og cellulære strukturer( inkludert sjeldne).
- Høy grad av objektivitet ved måling av luminescensintensitet( fluorescens).
Hvor å søke?
Spekteret for anvendelse av flytcytometri er uvanlig bredt. Det brukes til og med i industrien til å kontrollere produksjonsprosessen. Vi vil demonstrere dette ved å gi informasjon i form av lister for klarhet. I onkologi
Denne delen legemidlet flowcytometri blir brukt til formålet:
- kvantitativ analyse av intracellulære strukturer( DNA);
- studie av de viktigste parametrene i celle syklusen;
- identifisering og telling av celler som tilhører ulike perioder av cellesyklusen;
- deteksjon av aneuploide kloner( unormale celler med ikke-standard sett av kromosomer), noe som indikerer utvikling av akutt leukemi;
- avsløre graden av proliferativ aktivitet( tendens til aktiv deling) av aneuploid kloner;
- -deteksjon av tumormarkører;
- overvåker statusen til pasienter i fare;
- vurderer immunsystemets funksjon og den funksjonelle konsistensen av immunceller;
- -påvisning av subpopulasjoner av lymfocytter( denne egenskapen tillater å vurdere immunitetsstatusen).
Video av flowcytometri ved diagnose av akutt leukemi:
Immunology Flow-cytometri tillater:
- å utføre immunfenotyping( bestemme type og funksjonell tilstand) av blodceller;
- angi fagocytisk aktivitet av immunceller( indikert bakterier fangst, merket med fluorescerende fargestoffer);
- identifiserer intracellulære proteiner;
- bestemmer omfanget av proliferativ aktivitet;
- for å undersøke stadiene av cellesyklusen;
- vurdere graden av cytotoksisitet( beskyttende mekanisme for å ødelegge den subcellulære nivå til protozoer, bakterier og virus) celle. Cytologi
Flow gir cytometri omfattende data til:
- nøyaktig innstilt cytomorphological eventuelle cellekarakteristikker( dens størrelse, graden av asymmetri, er forholdet mellom kjernen og cytoplasmaet);
- evaluerer aktiviteten til enzymer som utgjør cellen;
- analyserer stadiene av celle syklusen;
- måler fysiologiske intracellulære parametere( pH-nivå, cellemembranpotensial, konsentrasjon av frie ioner).
Hematologi ved flowcytometri kan Hematologer:
- analysere subpopulasjoner av blodceller;
- å telle antall retikulocytter og blodplater ved hjelp av bestemte markører;
- vurderer konsekvensene av gjenværende( gjenværende, ikke fullt helbredet) sykdom;
- diagnostiserer akutt leukemi;
- utføre en differensialdiagnose reaktiv lymphocytosis og lymfoproliferative sykdommer( sykdommer hvor de angrepne celler som har lymfoid natur);
- for å diagnostisere sykdommer av lymfoproliferativ etiologi.
Pharmaceuticals
Flow-cytometri hjelper farmakologer:
- satt ekspresjonsnivå( følsomhet av tumorer av forskjellige lokaliseringer behandlings legemidler) proteinmarkører;
- måler aktiviteten til enzymer som utgjør cellene;
- engasjert i studiet av virkningen av bioaktive stoffer på tilstanden av celler i menneskekroppen, for å bestemme hvilken som helst fase av cellesyklusen.
jordbruk
metode for flowcytometri er mye brukt av forskere som spesialiserer i dannelse av nytt plante og dyreavling, som gjør det mulig å: bestemme
- ploiditet( antall identiske kromosomsett i kjernen) celler;
- utføre en analyse av et hvilket som helst stadium av cellesyklusen;
- utfører analysen av innholdet i protoplaster( bakterie- eller planteceller), og sorterer dem også i henhold til de fastsatte parametrene.