A citometria quantitativa é uma técnica relativamente nova para a pesquisa microbiológica de meios de dispersão, realizada com a ajuda de equipamentos especiais. A citometria é estática e fluida.
A citometria estática é realizada utilizando microscópio confocal;Na ausência deles, os microscópios luminescentes ligeiramente modificados estão equipados com sistemas de análise de imagem simples e baratos.
A citometria de fluxo é realizada em dispositivos especiais - citometros de classificação e fluxo.
Ambas as variantes da citometria quantitativa possuem a mais ampla aplicação possível na prática de pesquisa médica e biológica. Apesar da diferença no material clínico utilizado e dos modelos experimentais, as tarefas que eles resolvem estão sujeitas aos princípios gerais do estudo.
O que é citometria de fluxo?
A citometria de fluxo é uma técnica para estudar substâncias de dispersão no modo de análise de peça de partículas que fazem parte de uma fase dispersa a partir de sinais obtidos durante a fluorescência e dispersão de luz.
A técnica de citometria de fluxo foi desenvolvida com base em experiências especiais para determinar o tamanho das partículas em estudo e contar seu número.
O primeiro classificador de células foi criado em 1965 e, desde o início da próxima década, a produção de instrumentos projetados para medir a intensidade de fluorescência em vários comprimentos de onda foi configurada para determinar vários parâmetros das células em estudo.
Pesquisadores modernos usam dois tipos de instrumentos para a citometria de fluxo: dispositivos
- projetados para medir a fluorescência em dois( ou mais) comprimentos de onda e luz de dispersão em um ângulo de dez( a chamada dispersão direta de pequeno ângulo) e noventa graus. Dispositivos desse tipo são fáceis de usar.
- Classificadores de células bastante pesados que podem medir mais de cinco parâmetros dos núcleos ou partículas investigados e também classificar células que possuem um determinado conjunto de parâmetros.
O design dos citometros de fluxo modernos é tão complexo e variado que é difícil generalizar e sistematizar, mas existem alguns pontos comuns comuns para todos os dispositivos:
- É necessária uma suspensão homogênea de células de um determinado tipo para qualquer tipo de análise de citómetro.
- Não deve haver falta de número de células ou seus núcleos.
- Para evitar que as células se juntem, o pesquisador deve ter informações completas sobre a natureza da dispersão da luz e ter tabelas com os dados relevantes à mão.
Amostras
Durante estudos médicos e biológicos, amostras preparadas a partir de células:
- de medula óssea;Sangue
- ;
- líquido cefalorraquidiano( LCR);
- do fluido sinovial( articular);
- líquido pleural;
- fluido peritoneal( ascite) acumulado na cavidade abdominal durante o desenvolvimento de ascite;
- de tecidos tumorais e saudáveis.
Princípio do método de citometria de fluxo
Os princípios subjacentes ao procedimento citométrico são extremamente simples.
Uma suspensão preparada a partir de células previamente marcadas com anticorpos monoclonais fluorescentes ou fluorocromos é colocada num fluxo de meio de dispersão passado através de uma célula de fluxo.
A focagem hidrodinâmica de um jato de uma suspensão de células em um jato de um meio de dispersão leva ao fato de que as células ou seus núcleos em estudo são alinhados individualmente e, nesta ordem, cruzam um feixe de luz focada( geralmente laser).
A luz que emana dos fluoroquromos é focada por meio de um sistema óptico constituído por vários espelhos e lentes e depois decomposta em componentes específicos.
Os sinais de luz recebidos são submetidos à análise e transformação em pulsos elétricos e, em seguida, a certas formas aceitáveis para o processamento e armazenamento de informações recebidas pelo computador.
Fluorochromes
A fim de facilitar o processo de determinação das estruturas celulares durante o procedimento de citometria de fluxo, o meio de dispersão utilizado é matizado com corantes fluorescentes especiais-fluorocromos.
Após esse tratamento, as células sob investigação adquirem a capacidade de fluorescer( brilho) sob a influência de um feixe de raios de luz.
Ao escolher um corante, use uma série de critérios:
- O fluorochrome usado deve ser específico para o DNA sob investigação.
- As características espectrais do corante devem corresponder às capacidades do equipamento utilizado.
- Um fator importante é o custo do fluorocromo( não deve ser muito alto).
- Os corantes utilizados devem ser fáceis de usar( ter estabilidade e boa solubilidade).
Um dos fluoroquromos mais populares é o iodeto de propídio: suas características espectrais são ideais para a realização de citometria de fluxo.
Para ativar a fluorescência usando iodeto de propídio, os pesquisadores recorrem a um laser de argônio convencional( seu comprimento de onda de trabalho é de 480 nm).A área da seção fluorescente é tal que nos permite usar o fluorochrome acima mencionado para realizar medições de vários parâmetros.
Para citometria de fluxo, também use:
- isotiocianato de fluoresceína;
- phycoerythrins( Cy5, Cy7, Texan red);
- allophycocyanin;
- Proteína Peridinina-Clorofila.
Independentemente do corante envolvido no procedimento, sua quantidade deve ser diretamente proporcional ao conteúdo do DNA na estrutura da célula.
A fim de obter uma coloração qualitativa de todas as estruturas celulares, a quantidade de fluorochrome usada deve ser excessiva.
A maioria dos fluorocromos que entram em contato com o DNA não pode passar pelas membranas das células intactas. Para aumentar a permeabilidade das membranas celulares, as células sob investigação são tratadas com surfactantes( detergentes) ou com álcool.
Vantagens
Podem considerar-se vantagens indubitáveis de citometria de fluxo:
- Alta( até cem mil episódios por segundo) velocidade da análise.
- Capacidade de determinar subpopulações celulares.
- Capacidade de realizar análises de um enorme( até 108 elementos em um ml de meio de dispersão) do número de células.
- Capacidade de determinar os parâmetros de quaisquer células e estruturas celulares( incluindo raras).
- Alto grau de objetividade na medida da intensidade da luminescência( fluorescência).
Onde se candidatar?
O espectro de aplicação da citometria de fluxo é excepcionalmente amplo.É usado mesmo na indústria para controlar o processo de produção. Vamos demonstrar isso fornecendo informações sob a forma de listas para maior clareza.
Oncologia
Nesta seção de medicina, a citometria de fluxo é usada para:
- análise quantitativa de estruturas intracelulares( DNA);Estudos
- dos principais parâmetros do ciclo celular;
- identificação e contagem de células pertencentes a diferentes períodos do ciclo celular;
- detecção de clones aneuploides( células anormais com conjunto não padrão de cromossomos), indicativo do desenvolvimento de leucemia aguda;
- revelando o grau de atividade proliferativa( tendência para a divisão ativa) de clones aneuploides;
- detecção de marcadores tumorais;
- monitoramento do status de pacientes em risco;
- avaliando o funcionamento do sistema imunológico e a consistência funcional das células imunes;
- detecção de subpopulações de linfócitos( esta característica permite avaliar o estado de imunidade).
Vídeo sobre citometria de fluxo no diagnóstico de leucemia aguda:
Imunologia
O método de citometria de fluxo permite:
- para realizar imunofenotipagem( determinar o tipo e estado funcional) das células do sangue;
- estabelece a atividade fagocítica das células imunes( isto é indicado pela captura de bactérias marcadas com corantes fluorescentes);
- identifica proteínas intracelulares;
- determina a extensão da atividade proliferativa;
- para investigar os estágios do ciclo celular;
- avalia o grau de citotoxicidade( um mecanismo de proteção que permite a destruição de protozoários, bactérias e vírus) no nível intracelular.
Citologia
A citometria de fluxo fornece dados abrangentes que permitem:
- estabelecer inequivocamente as características citomorfológicas de qualquer célula( tamanho, nível de assimetria, correlação entre o núcleo e o citoplasma);
- avalia a atividade das enzimas que compõem a célula;
- analisa os estágios do ciclo celular;
- mede parâmetros intracelulares fisiológicos( nível de pH, potencial de membrana celular, concentração de iões livres).
Hematologia
Com a ajuda da citometria de fluxo, os hematologistas podem:
- analisar a composição da subpopulação das células do sangue;
- para contar o número de reticulócitos e plaquetas com a ajuda de marcadores específicos;
- avalia as conseqüências da doença residual( residual, não completamente curada);
- diagnosticar leucemia aguda;
- realiza diagnósticos diferenciais de linfocitose reativa e doenças linfoproliferativas( doenças nas quais as células com natureza linfóide são afetadas);
- para diagnosticar doenças de etiologia linfoproliferativa.
Farmacologia
A citometria de fluxo ajuda os farmacologistas:
- a estabelecer o nível de expressão( sensibilidade dos tumores de diferentes localizações ao tratamento medicamentoso) de marcadores de proteínas;
- mede a atividade das enzimas que compõem as células;
- participou no estudo da ação de substâncias bioativas no estado das células do corpo humano, para determinar qualquer estágio do ciclo celular.
Agricultura
O método de citometria de fluxo é usado ativamente por cientistas especializados em criação de novas espécies de plantas e criação de raças de gado, porque permite:
- determinar a ploidia( o número de conjuntos cromossômicos idênticos nos núcleos) das células;
- realiza uma análise de qualquer estágio do ciclo celular;
- realiza a análise dos conteúdos de protoplastos( células bacterianas ou de plantas), e também classificá-los de acordo com os parâmetros estabelecidos.