Kvantitativ cytometri är en relativt ny teknik för mikrobiologisk undersökning av dispersionsmedia, utförd med hjälp av specialutrustning. Cytometri är statisk och flytande.
Statiskt cytometri utförs med hjälp av konfokala mikroskop;I avsaknad av dem är lätt modifierade luminescerande mikroskop utrustade med enkla och billiga bildanalyssystem.
Flödescytometri utförs på speciella enheter - sorterings- och flödescytrometrar.
Båda varianterna av kvantitativ cytometri har bredast möjliga tillämpning vid utövande av medicinsk och biologisk forskning. Trots skillnaden i det använda kliniska materialet och de experimentella modellerna är de uppgifter de löser utsatta för de allmänna principerna för studien.
Vad är flödescytometri?
flödescytometri teknik som kallas studie ämnen i dispersionen läge separerings analysera partiklar innefattande den dispergerade fasen av signaler mottagna vid fluorescens och ljusspridning.
Flödescytometritekniken utvecklades på grundval av speciella experiment för att bestämma storleken på de partiklar som studerades och räkna deras antal.
första cellen sorterare skapades 1965 år, men sedan början av nästa årtionde arrangerades produktion av utrustning för mätning av fluorescensintensitet vid flera våglängder för att bestämma flera parametrar för den studerade cellen.
för forskare Modern flödescytometri instrument används två typer:
- Instrument för mätning av fluorescens vid två( eller flera) våglängder och ljusspridning i en vinkel av tio( det så kallade små vinklar framåtspridning) och nittio grader. Enheter av denna typ är lätta att använda.
- Ganska besvärliga cellsorterare som kan mäta mer än fem parametrar av de undersökta kärnorna eller partiklarna och också sortera celler som har en viss uppsättning parametrar.
enhet avancerade flödescytometrar är så komplexa och mångskiftande att det är svårt att varje generalisering och systematisering, men några allmänna punkter, som är gemensam för alla enheter, fortfarande existerar:
- för analys på cytometern av något slag kräver en homogen suspension av celler av en viss typ.
- Det bör inte finnas någon brist på antalet celler eller deras kärnor.
- För att förhindra att cellerna klibbar, måste forskaren ha fullständig information om beskaffenheten av ljusets spridda och ha tabeller med relevanta uppgifter till hands.
Prover
Under medicinska och biologiska studier, prov framställda från celler:
- av benmärg;
- blod;
- cerebrospinalvätska( CSF);
- av den synoviala( artikulära) vätskan;
- pleuralvätska;
- peritoneal( ascites) vätska som ackumuleras i bukhålan under utveckling av ascites;
- av tumör och friska vävnader.
Principen för flödescytometrimetoden
Principerna för den cytometriska proceduren är extremt enkla.
En suspension framställd från celler som tidigare märkts med fluorescerande monoklonala antikroppar eller fluorokrom placeras i ett flöde av dispersionsmedium som passerar genom en flödescell. Hydrodynamisk fokusering
cellsuspensionsstråle in i en ström av dispersionsmediet leder till det faktum att de undersökta cellerna eller deras kärnor är anordnade var för sig och i denna ordning tvärbalken fokuserat ljus( typiskt laser) ljus.
Det ljus som härrör från fluorokromerna fokuseras med hjälp av ett optiskt system som består av flera speglar och linser och sönderdelas sedan i specifika komponenter.
De mottagna ljussignalerna utsätts för analys och transformation i elektriska pulser, och sedan till vissa former som är acceptabla för datorbehandling och lagring av den mottagna informationen.
Fluorokrom
För att underlätta förfarandet för bestämning av de cellulära strukturerna under flödescytometriförfarandet är det använda dispersionsmediet tonat med speciella fluorescerande färgämnen-fluorokromer.
Efter en sådan behandling, erhåller cellerna förmågan att fluorescera( ljus) under påverkan av en stråle av ljusstrålar.
Vid val av färgämne används ett antal kriterier:
- Den använda fluorokromen måste vara specifik för det DNA som undersöks.
- Färgets spektrala egenskaper måste matcha egenskaperna hos den använda utrustningen.
- En viktig faktor är kostnaden för fluorokrom( den ska inte vara mycket hög).
- Färgämnena som används ska vara lätta att använda( ha stabilitet och bra löslighet).
En av de mest populära fluorokromerna är propidiumjodid: dess spektrala egenskaper är idealiska för att utföra flödescytometri.
För att aktivera fluorescens med användning av propidiumjodid tillgodoses forskare till en konventionell argonlaser( dess arbetsvåglängd är 480 nm).Det fluorescerande snittets område är sådant att det tillåter oss att använda ovannämnda fluorokrom för att utföra flerparametermätningar.
För flödescytometri används följande också:
- fluoresceinisotiocyanat;
- -fycoerytriner( Cy5, Cy7, Texanröd);
- alloficocyanin;
- -peridinin-klorofyllprotein.
Oavsett vilket färgämne som är involverat i förfarandet bör dess mängd vara direkt proportionell mot innehållet av DNA i cellstrukturen.
För att uppnå en kvalitativ färgning av alla cellulära strukturer måste den använda fluorokrommängden vara överdriven.
De flesta fluorokrom som kommer i kontakt med DNA kan inte passera genom membran av intakta celler( intakta).För att öka permeabiliteten hos cellmembran behandlas de celler som undersöks med ytaktiva medel( detergenter) eller med alkohol.
Fördelar med
De otvivelaktiga fördelarna med flödescytometri kan övervägas:
- Hög( upp till hundra tusen episoder per sekund) analyshastighet.
- Förmåga att bestämma cellpopulationer.
- Möjligheten att utföra analys av en stor( upp till 108 element i en ml av ett dispersionsmedium) av antalet celler.
- Förmåga att bestämma parametrarna för alla celler och cellulära strukturer( inklusive sällsynta).
- Hög grad av objektivitet vid mätning av luminescensintensitet( fluorescens).
Var ska man ansöka?
Spektrumet för applicering av flödescytometri är ovanligt brett. Det används även i industrin för att styra produktionsprocessen. Vi kommer att demonstrera detta genom att tillhandahålla information i form av listor för tydlighet.
I onkologi
I detta avsnitt av medicin används flödescytometri för att:
- kvantifiera intracellulära strukturer( DNA);
- -studie av huvudparametrarna i cellcykeln;
- identifiering och räkning av celler som tillhör olika perioder av cellcykeln;
- -detektering av aneuploidkloner( onormala celler med icke-standardkromosomuppsättning), som indikerar utvecklingen av akut leukemi;
- avslöja graden av proliferativ aktivitet( tendens mot aktiv uppdelning) av aneuploidkloner;
- -detektion av tumörmarkörer;
- övervakar status för patienter i riskzonen
- bedömer immunsystemets funktion och den funktionella konsistensen hos immunceller;
- -detektion av subpopulationer av lymfocyter( denna egenskap gör det möjligt att bedöma immunitetstillståndet).
Video på flödescytometri vid diagnos av akut leukemi:
Immunologi
Flödescytometrimetoden möjliggör:
- för att utföra immunofenotypning( bestäm typ och funktionellt tillstånd) för blodceller;
- fastställer den fagocytiska aktiviteten hos immunceller( detta indikeras genom infångning av bakterier märkta med fluorescerande färgämnen);
- identifierar intracellulära proteiner;
- bestämmer omfattningen av proliferativ aktivitet;
- för att undersöka stadierna av cellcykeln;
- bedöma graden av cytotoxicitet( skyddande mekanism för att förstöra den subcellulära nivån till protozoer, bakterier och virus) cell. Cytologi
Flow tillhandahåller cytometri omfattande data till:
- noggrant inställd cytomorphological eventuella cellegenskaper( dess storlek, graden av asymmetri, förhållandet mellan kärnan och cytoplasman);
- utvärderar aktiviteten hos de enzymer som utgör cellen;
- analyserar stadierna av cellcykeln;
- mäter fysiologiska intracellulära parametrar( pH-nivå, cellmembranpotential, koncentration av fria joner).
Hematologi med flödescytometri kan hematologer:
- analysera subpopulationer av blodceller;
- att räkna antalet retikulocyter och blodplättar med hjälp av specifika markörer;
- bedömer konsekvenserna av kvarvarande( återstående, inte fullständigt helad) sjukdom;
- diagnostiserar akut leukemi;
- utföra en differentiell diagnos reaktiv lymfocytos och lymfoproliferativa sjukdomar( sjukdomar i vilka de påverkade cellerna som har lymfoida natur);
- för att diagnostisera sjukdomar av lymfoproliferativ etiologi.
Pharmaceuticals
Flow hjälper cytometry farmakologer:
- set expressionsnivå( känslighet av tumörer av olika lokaliseringar behandlings läkemedel) proteinmarkörer;
- mäter aktiviteten hos enzymer som utgör cellerna;
- engagerad i studien av verkan av bioaktiva ämnen på människokroppens tillstånd, för att bestämma varje stadium av cellcykeln.
jordbruk
metod för flödescytometri används ofta av forskare som specialiserat sig på uppfödning av nya växt- och djurförädling, eftersom det tillåter dig att:
- bestämma ploidi( antal identiska kromosomuppsättningar i kärnan) celler;
- utför en analys av varje stadium av cellcykeln;
- utför analysen av innehållet i protoplaster( bakterie- eller växtceller) och sortera dem också enligt de angivna parametrarna.