Kvantitatiivne tsütomeetria on suhteliselt uus meetod dispersioonikeskkonna mikrobioloogiliseks uurimiseks, mis viiakse läbi spetsiaalse varustuse abil. Tsütomeetria on staatiline ja voolav.
Staatiline tsütomeetria tehakse konfokaalsete mikroskoopidega;nende puudumisel on pisut muudetud luminestsentsmikroskoobid varustatud lihtsate ja odavate kujutiste analüüsisüsteemidega.
voolutsütomeetria viiakse läbi spetsiaalsetel seadmetel - sorteerimis- ja voolu tsütromeetritel.
Mõlemad kvantitatiivse tsütomeetria variandid on võimalikult laialdaselt rakendatud meditsiiniliste ja bioloogiliste uuringute praktikas. Hoolimata kasutatud kliinilise materjali ja eksperimentaalsete mudelite erinevusest sõltuvad nende poolt lahendatud ülesanded uuringu üldpõhimõtetest.
Mis on voolutsütomeetria?
voolutsütomeetriaga tehnikat nimega uuringu ainete hajumist režiimis Singler analüüsides sisaldavate osakeste hajutatud olekus signaalide saabus fluorestsentsi ja valguse hajumise.
Voolutsütomeetriline meetod töötati välja spetsiaalsete katsete põhjal, mis määravad uuritavate osakeste suuruse ja arvutavad nende arvu.
esimene lahter sorteerija loodi 1965. aastal, kuid algusest järgmise kümnendi korraldati tootmine mõõteseadmed fluorestsentsi intensiivsust mitmes lainepikkustel, et määrata mitmeid parameetreid uuritud rakkude.
teadlaste Modern voolutsütomeetria vahendeid kasutatakse kahte tüüpi:
- mõõtmise instrumendid fluorestsentsi kaks( või rohkem) lainepikkustel ja valguse hajumise nurga kümme( nn väike-nurk edasi hajumise) ja üheksakümne kraadi. Seda tüüpi seadmeid on lihtne kasutada.
- üsna tülikas rakusorterit võimeline mõõtma üle viie parameetrid tuumade või osakesed, samuti rakkude sorteerimiseks millel on spetsiifiline parametrisarja.
seadme arenenud voolutsütomeetrid on nii keeruline ja mitmekesine, et see on raske igal üldistus ja süstematiseerimine, kuid mõned üldised punktid, ühine kõigile seadmetele, on ikka veel olemas:
- For analüüsi cytometer tahes tüüpi nõuab homogeense suspensiooni rakkudes teatud tüüpi.
- Rakkude või nende tuumade arvu puudus ei tohiks olla.
- Selleks, et rakud ei jääks kokku, peab teadlal olema täielik teave valguse hajumise olemuse kohta ja tabelid asjakohaste andmetega.
proovid
Meditsiiniliste ja bioloogiliste uuringute käigus tehti rakkudest valmistatud proovid: luuüdi
- ;
- veri;
- tserebrospinaalvedelik( CSF);Sünoviaalse( liigese) vedeliku
- ;
- pleura vedelik;
- peritoneaalne( astsiit) vedelik koguneb kõhuõõnde astsiidi tekkimise ajal;Kasvaja ja terved kudedes
- .
Voolutsütomeetrilise meetodi
põhimõte Tsütomeetrilise protseduuri aluseks olevad põhimõtted on äärmiselt lihtsad.
suspensioonid valmistatakse rakkudest eelnevalt märgistatud fluorestseeruva monokloonseid antikehi või fluorokroomide pannakse voolu dispersioonikeskkonnaks, kantakse läbi vooluelementi. Hüdrodünaamiline keskendudes
rakususpensiooni jet voogu dispersioonikeskkonnaks põhjustab asjaolu, et uuritud rakkude või nende tuumad on paigutatud ühe- ning selles järjestuses risttala keskendunud väikesed( tavaliselt laseri) valguse eest.
Fluorokroomidest tulenev valgus keskendub optilise süsteemi abil, mis koosneb mitmest peeglist ja läätsest ning seejärel laguneb spetsiifilisteks komponentideks.
Vastuvõetud valgussignaalid allutatakse analüüsimiseks ja transformatsiooniks elektriimpulssideks ning seejärel teatud vormidesse, mis on vastuvõetav vastuvõetud teabe arvutite töötlemiseks ja salvestamiseks.
Fluorokroomid
Hõlbustamaks määramise menetlust raku struktuuride voolutsütomeetrilist kasutatavad protseduurid dispersioonikeskkonnas värvitud spetsiaalse fluorestseeruva värviga - fluorokroomide.
Pärast sellist töötlemist omandavad katsetatud rakud fluorestsentsi( valguse) valguse kiirte piigi mõjul.
Värva valimisel kasutatakse mitmeid kriteeriume:
- Kasutatud fluorokroom peab olema uuritava DNA spetsiifiline.
- Värvi spektraalomadused peavad vastama kasutatavate seadmete võimalustele.
- Oluliseks teguriks on fluorokroomi hind( see ei tohiks olla väga kõrge).
- Kasutatavad värvid peaksid olema kergesti kasutatavad( neil on stabiilsus ja hea lahustuvus).
Üks populaarsemaid fluorokromasid on propiidiumjodiid: selle spektraalomadused sobivad ideaalselt voolutsütomeetria läbiviimiseks. Aktiveerimiseks
fluorestsentsi propiidiumjodiidi, on uurijad kasutanud kasutades tavapärast argoonlaser( töötavad lainepikkus on 480 nm).Fluorestseeriva sektsiooni piirkond on selline, et see võimaldab meil kasutada ülalnimetatud fluoro-chrome mitmeparameetrite mõõtmiseks.
Voolutsütomeetrias kasutatakse ka järgmist:
- fluorestseiin isotiotsüanaat;
- fükoerütriine( Cy5, Cy7, Texan punane);
- allofikotsüaniin;
- peridinün-klorofüll valk.
. Olenemata sellest, milline värvaine on protsessis kaasatud, peaks see kogus olema otseselt proportsionaalne DNA-i sisaldusega rakukonstruktsioonis.
Selleks, et saavutada kõigi rakuliste struktuuride kvalitatiivne värvimine, peab fluorohroomi kogus olema ülemäärane.
Enamik fluorookroomidest, mis puutuvad kokku DNA-ga, ei suuda läbida terviklike( intaktsete) rakkude membraane. Rakumembraanide läbilaskvuse suurendamiseks töödeldakse uuritavaid rakke pindaktiivsete ainetega( detergendid) või alkoholiga.
Kasu
vaieldamatu eeliseid läbivoolutsütomeetria võib pidada:
- kõrge( kuni sada tuhat episoodi sekundis) analüüsi kiirust.
- Võime määrata rakupopulatsioone.
- Võime analüüsida rakkude arvu tohutut( kuni 108 elementi ühes ml dispersioonikandjas).
- Võime määrata kõigi rakkude ja raku struktuuride( sealhulgas haruldaste) struktuuri parameetreid.
- Luminestsentsi intensiivsuse( fluorestsentsi) mõõtmisel objektiivsuse kõrge tase.
Kuhu taotleda?
Voolutsütomeetria rakendus spekter on ebatavaliselt lai. Seda kasutatakse tootmisprotsessi juhtimiseks isegi tööstuses. Näitame seda, esitades teabe selguse huvides nimekirjade kujul. Onkoloogias
See lõik meditsiinis läbivoolutsütomeetriat kasutatakse sel eesmärgil:
- kvantitatiivne analüüs rakusisese struktuurid( DNA);
- uuring rakutsükli peamistest parameetritest;
- rakutsükli erinevate perioodide rakkude identifitseerimine ja loendamine;
- avastamine aneuploid kloonid( ebanormaalsete rakkude mittestandardse komplekti kromosoome), näidates arengut äge leukeemia;
- , mis avaldas aneuploid-kloonide proliferatiivse aktiivsuse taset( aktiivsuse jaotumise tendents);Kasvaja markerite avastamine
- ;
- jälgib riskirühma kuuluvate patsientide seisundit;
- hindab immuunsüsteemi toimimist ja immuunrakkude funktsionaalset konsistentsi;
- lümfotsüütide subpopulatsioonide tuvastamine( see omadus võimaldab hinnata immuunsuse seisundit).
Video läbivoolutsütomeetria diagnoosimisel äge leukeemia:
Immunology Voolutsütomeetria võimaldab:
- , et teostada vererakkude immunofenotüüpide määramine( tüüp ja funktsionaalne seisund);
- seatud fagotsütoosivõime immuunrakke( näidatud bakterite püüdmise märgistati fluorestsentsvärvainetega);
- identifitseerib rakusiseseid valke;
- määrab proliferatiivse aktiivsuse ulatuse;
- uurib rakutsükli etappe;
- hinnata tsütotoksilisuse taseme( kaitsemehhanism hävitada rakusisene tase algloomad, bakterid ja viirused) raku. Tsütoloogial
Voolutsütomeetria annab põhjaliku andmeid:
- täpselt määrata cytomorphological tahes raku omadused( selle suurus, tase asümmeetria suhe tuumas ja tsütoplasmas);
- hindab raku moodustavate ensüümide aktiivsust;
- analüüsib rakutsükli etappe;
- mõõdab füsioloogilisi intratsellulaarseid parameetreid( pH tase, rakumembraani potentsiaal, vaba ioonide kontsentratsioon).
Hematoloogia voolutsütomeetriaga võib hematoloogidele:
- analüüsida alampopulatsioonidele vererakkude
- retikulotsüütide ja trombotsüütide arvu arvutamiseks konkreetsete markerite abil;
- hindab jääkide( järelejäänud, mitte täielikult ravitud) haiguse tagajärgi;
- diagnoosige ägeda leukeemia;
- teostada diferentsiaaldiagnoosimist reaktiivsed lümfotsütoosiga ja lümfoproliferatiivsed haigused( haigused, mille tabandunud rakud, millel lümfoidse milline);
- lümfoproliferatiivse etioloogia haiguste diagnoosimiseks.
Pharmaceuticals
Voolutsütomeetria aitab pharmacologists:
- seatud ekspressioonitaset( tundlikkus kasvajate erinevate lokaliseerimised ravi narkootikumid) valgumarkereid;
- mõõdab rakkude moodustavate ensüümide aktiivsust;
- tegelenud õpib toime bioaktiivsete ainete organismis seisundist inimrakkude määrab kõik rakutsükli faasis.
põllumajanduse
meetod läbivoolutsütomeetria kasutatakse laialdaselt teadlased spetsialiseerunud aretus uute taimede ja loomade kasvatamine, sest see võimaldab teil:
- kindlaks ploidsusele( mitmest identsest kromosoomi komplekti tuumas) rakud;
- analüüsib rakutsükli mis tahes etapi;
- teostada sisuanalüüsile protoplasma( bakteri- või taimerakkudes) ja sorteerimine nende tootmiseks vastavalt etteantud parameetreid.