Kiekybinis citometrijos - gana nauja technika mikrobiologinio tyrimo dispersijos terpės, atliekamas su specialia įranga pagalbą.Citometrija yra statinė ir tekanti.
Statiška citometrija atliekama naudojant konfokalinius mikroskopus;jei jų nėra, šiek tiek modifikuoti liuminescenciniai mikroskopai aprūpinti paprasta ir pigi vaizdo analizės sistema.
srauto citometrija atliekama naudojant specialius prietaisus - rūšiavimo ir srauto citrometrus.
Abiejų kiekybinės citometrijos variantai yra kuo plačiau taikomi medicininių ir biologinių tyrimų praktikoje. Nepaisant to, kad naudojama klinikinė medžiaga ir eksperimentiniai modeliai skiriasi, jiems keliami uždaviniai priklauso nuo bendrų tyrimo principų.
Kas yra srauto citometrija?
srauto citometrijos technika vadinama tyrimo medžiagų dispersijoje režimas singler analizuoti dalelių, apimančių dispersinė fazė signalus fluorescencijos ir šviesos sklaidos gavo.
Tėkmės citometrijos metodas buvo sukurtas remiantis specialiais eksperimentais, siekiant nustatyti tiriamų dalelių dydį ir skaičiuoti jų skaičių.
pirmasis ląstelių rūšiavimo buvo sukurtas 1965 metais, tačiau nuo kito dešimtmečio pradžioje buvo surengtas gamybą prietaisų matavimo fluorescencijos intensyvumo keliuose bangos ilgio nustatyti kelis parametrus studijuojamos langelį.
Mokslininkų Modern tėkmės citometrijos priemonių yra naudojamos dviejų tipų:
- matavimo prietaisai fluorescenciją ties dviejų( ar daugiau) bangos ilgio ir šviesos sklaidos nuo dešimties( vadinamoji mažos kampas priekį sklaida) ir devyniasdešimt laipsnių kampu. Tokio tipo prietaisai yra paprasti naudoti.
- o sudėtinga ląstelių rūšiavimo gali matuoti daugiau nei penkis parametrus branduolių arba dalelių, ir taip pat, kad rūšiuoti ląsteles, turinčias tam tikro rinkinio parametrų.
prietaisas pažangios srauto citometrai yra tokia sudėtinga ir įvairi, kad sunku bet apibendrinimo ir sisteminimo, bet keletą bendrų taškų, bendra visiems prietaisams, vis dar egzistuoja:
- analizei dėl bet kokio tipo citometre reikalauja vienalytė suspensija ląstelių tam tikro tipo.
- Ląstelių ar jų branduolių skaičius neturi būti mažesnis.
- Norėdami išvengti joms sulipti ląstelių, tyrėjas turi turėti visą informaciją apie šviesos sklaidos pobūdį ir turėti po ranka stalą su atitinkamais duomenimis.
mėginiai
Atliekant medicininius ir biologinius tyrimus, iš ląstelių pagaminti mėginiai:
- kaulų čiulpų;
- kraujas;
- cerebrospinalinis skystis( CSF);Sinusinio( sąnario) skysčio
- ;
- pleuros skystis;
- peritoninis( ascitas) skystis, kaupiantis pilvo ertmėje ascito metu;
- iš navikų ir sveikų audinių.
principas tėkmės citometrijos metodu
principų, kuriais grindžiami citometrinės procedūrą yra labai paprasta.
suspensijos, pagaminti iš ląstelių iš anksto žymėtas liuminescencinių monokloninių antikūnų arba liuminoforais yra dedamas į dispersijos terpės tekėjimas, perduotą per celę.Hidrodinaminis dėmesio
ląstelių suspensija srovę į dispersijos terpėje srauto veda į tai, kad tirtos ląstelės arba jų branduoliai yra išdėstyti atskirai ir šia tvarka perdavimas sija orientuota šviesą( paprastai lazerio šviesą).
šviesa liuminoforais, orientuota pagal optinę sistemą sudaro keli veidrodžiai ir lęšių, ir tada plisti tam tikrų komponentų.
gavo šviesos signalus yra analizuojamas ir konversiją į elektros impulsų, ir tada - tam tikrų formų, tinkama apdoroti kompiuteriu ir gautą informaciją saugoti.
fluorochromai
Siekiant palengvinti ląstelių struktūrų nustatymo procesą srauto citometrijos metodu, naudojama dispersinė terpė yra tonuota specialiais fluorescenciniais dažais ir fluorochromais.
Po tokio gydymo bandomosios ląstelės įgauna fluorescencinę šviesą( šviesa) šviesos spindulių pluošto įtaka.
Renkantis dažiklį, naudojami keli kriterijai:
- Naudojamas fluorochromas turi būti specifinis tiriamoje DNR.
- Dažų spektrinės charakteristikos turi atitikti naudojamos įrangos galimybes.
- Svarbus faktorius yra fluorochromo kaina( ji neturėtų būti labai didelė).
- Naudojami dažai turi būti lengvai naudojami( turi stabilumą ir gerą tirpumą).
Vienas iš populiariausių fluorochromų yra propidiumo jodidas: jo spektrinės charakteristikos idealiai tinka srautų citometrijai.
Norėdami aktyvuoti fluorescenciją naudojant propidiumą jodidas, mokslininkai kreipiasi į tradicinį argono lazerį( jo veikimo bangos ilgis yra 480 nm).Fluorescencinės sekcijos plotas yra toks, kad leidžia mums naudoti aukščiau minėtą fluorochromą, kad atliktų daug parametrų matavimus.
Tėkmės citometrijai taip pat naudojami:
- fluoresceino izotiocianatas;
- fikoeritrinai( Cy5, Cy7, Teksaso raudona);
- aloficocyanin;
- peridinino-chlorofilo baltymas.
Nepriklausomai nuo to, kuris dažiklis dalyvauja procedūroje, jo kiekis turi būti tiesiogiai proporcingas DNR kiekiui ląstelių struktūroje.
Norint pasiekti kokybišką visų korinių struktūrų dažymą, naudojamas fluorochromo kiekis turi būti pernelyg didelis.
Daugelis fluorochromų, kurie liečiasi su DNR, negali praeiti per sveikas( nepažeistąsias) ląsteles. Siekiant padidinti ląstelių membranų pralaidumą, tiriamos ląstelės apdorojamos paviršinio aktyvumo medžiagomis( plovikliais) arba alkoholiu.
privalumai Galima svarstyti neabejotinus srauto citometrijos pranašumus:
- High( iki šimto tūkstančių epizodų per sekundę) analizės greitis.
- Gebėjimas nustatyti ląstelių subpopuliacijas.
- Gebėjimas atlikti daugybę( iki 108 elementų viename mililitre dispersijos terpės) ląstelių skaičiaus analizę.
- Gebėjimas nustatyti bet kokių ląstelių ir korinių struktūrų( įskaitant retus) parametrus.
- Didelis liuminescencijos intensyvumo( fluorescencijos) matavimo objektyvumas.
Kur kreiptis?
Tėkmės citometrijos taikymo spektras yra neįprastai platus. Jis naudojamas net pramonėje gamybos proceso kontrolei. Mes tai parodysime pateikdami informaciją aiškesnių sąrašų forma.
Onkologijoje
Šiame vaisto skyriuje srauto citometrija yra naudojama:
- kiekybiškai įvertinant intracellular struktūras( DNR);
- pagrindinių ląstelės ciklo parametrų tyrimas;
- ląstelių, priklausančių skirtingiems ląstelės ciklo periodams, identifikavimas ir skaičiavimas;
- aptikimas aneuploidinių klonų( nenormalios ląstelės su nestandartiniu chromosomų rinkiniu), rodantis ūmios leukemijos atsiradimą;
- , parodantis aneuploidinių klonų proliferacinio aktyvumo( linkę į aktyvų susiskaidymą) laipsnį;
- aptikimas navikų žymeklių;
- rizikos grupei priklausančių pacientų būklės stebėjimas;
- įvertina imuninės sistemos veikimą ir imuninių ląstelių funkcinį nuoseklumą;
- nustato limfocitų subpopuliacijas( ši charakteristika leidžia įvertinti imuniteto būklę).
video apie srauto citometriją ūminės leukemijos diagnozėje:
imunologija
Tėkmės citometrijos metodas leidžia:
- atlikti kraujo ląstelių imunofenotipą( nustatyti rūšį ir funkcinę būseną);
- nustato imuninių ląstelių fagocitinį aktyvumą( tai rodo, kad bakterijos užfiksuotos fluorescuojančiomis dažikliais);
- identifikuoja ląstelių baltymus;
- nustato proliferacinės veiklos mastą;
- tirti ląstelių ciklo stadijas;
- įvertinti citotoksiškumo laipsnio( apsauginis mechanizmas sunaikinti Subląsteliniam lygį pirmuonių, bakterijų ir virusų) ląstelių.Citologija
tėkmės citometrijos teikia kompleksinius duomenis į:
- tiksliai nustatytą cytomorphological bet ląstelių charakteristikas( jos dydis, asimetrijos lygį, tarp branduolio ir citoplazmos santykis);
- vertina fermentų, kurie sudaro ląstelę, aktyvumą;
- analizuoja ląstelių ciklo stadijas;
- nustato fiziologinius intraląstelinius parametrus( pH, ląstelių membranos potencialą, laisvųjų jonų koncentraciją).
hematologinis tėkmės citometrijos gali Hematologai:
- analizuoti subpopuliacijas kraujo ląsteles,;
- skaičiuoti retikulocitų ir trombocitų skaičių naudojant specialius žymenis;
- įvertinti likutinės( likusios, nevisiškai išgydytos) ligos pasekmes;
- diagnozuoti ūminę leukemiją;
- atlikti diferencinį diagnozavimą reaktyviąją limfocitozė ir limfinio ligomis( ligomis, kurioje paveiktos ląstelės, turinčios limfinio pavidalu);
- diagnozuoti limfoproliferacinės etiologijos ligas.
farmacija
tėkmės citometrijos padeda Farmakologai:
- nustatyti ekspresijos lygį( jautrumas navikų įvairių lokalizacijos dėl vaistų) baltymų žymenų;
- nustato fermentų, kurie sudaro ląsteles, aktyvumą;
- tyrinėja bioaktyvių medžiagų poveikį žmogaus kūno ląstelių būsenai, kad nustatytų bet kurį ląstelės ciklo etapą.
Žemės ūkis
metodas tėkmės citometrijos yra plačiai naudojamas mokslininkų, besispecializuojančių naujos augalinės ir gyvūninės veislininkystė veislinis, nes jis leidžia jums:
- nustatyti ploidiškumą( skaičius vienodų chromosomų rinkinių branduolio) ląstelės;
- atlieka bet kurio ląstelių ciklo stadijos analizę;
- atlieka protoplastų( bakterijų ar augalų ląstelių) turinio analizę, taip pat rūšiuoja juos pagal nustatytus parametrus.