Kvantitatívna cytometria je relatívne nová technika mikrobiologického výskumu disperzných médií, vykonávaná pomocou špeciálneho zariadenia. Cytometria je statická a tečúca.
Statická cytometria sa uskutočňuje použitím konfokálnych mikroskopov;v neprítomnosti sú mierne upravené luminiscenčné mikroskopy vybavené jednoduchými a lacnými systémami na analýzu obrazu.
Prietoková cytometria sa vykonáva na špeciálnych prístrojoch - triedičoch a prietokomeroch.
Obidva varianty kvantitatívnej cytometrie majú čo najširšie uplatnenie v praxi lekárskeho a biologického výskumu. Napriek rozdielu v použitom klinickom materiáli a experimentálnych modeloch, úlohy, ktoré riešia, podliehajú všeobecným zásadám štúdie.
Čo je prietoková cytometria?
Prietoková cytometria je technika na štúdium disperzných látok v režime kusovej analýzy častíc, ktoré sú súčasťou dispergovanej fázy zo signálov získaných počas fluorescencie a rozptylu svetla.
Technológia prietokovej cytometrie bola vyvinutá na základe špeciálnych experimentov na určenie veľkosti skúmaných častíc a ich počet.
prvý triedením buniek bol vytvorený v 1965 roku, ale od začiatku budúceho desaťročia bola usporiadaná výroba zariadení na meranie intenzity fluorescencie na niekoľkých vlnových dĺžkach k určeniu viac parametrov študovaného bunky.
pre výskumné moderné prietokové cytometrie nástrojov sa používajú dva typy:
- prístroje na meranie fluorescencie na dvoch( alebo viacerých) vlnových dĺžok a rozptylu svetla v uhle desiatich( tzv malý uhol vpred rozptyl) a deväťdesiat stupňov. Zariadenia tohto typu sa ľahko používajú.
- pomerne ťažkopádny triedením buniek schopný merať viac ako päť parametrov jadier alebo častíc, a tiež triediť buniek, ktoré majú špecifickú sadu parametrov.
zariadenie pokročilé cytometer prúdenia sú tak zložité a rôznorodé, že je ťažké, aby akékoľvek zovšeobecnenie a systemizáciu, ale niekoľko všeobecných bodov, spoločný pre všetky zariadenia, stále existuje:
- Pre analýzu na cytometri akéhokoľvek typu vyžaduje homogénna suspenzia buniek určitého typu.
- Počet buniek alebo ich jadier by nemal byť nedostatočný.
- Aby sa zabránilo zhlukovaniu buniek, výskumník musí mať úplné informácie o povahe rozptylu svetla a mať po ruke tabuľku s príslušnými údajmi. Vzorky
Počas lekárskych a biologických štúdií boli vzorky pripravené z buniek:
- kostnej drene;Krv
- ;
- cerebrospinálna tekutina( CSF);
- synoviálnej( kĺbovej) tekutiny;
- pleurálna tekutina;
- peritoneálna( ascita) tekutina, ktorá sa nahromadila v brušnej dutine počas vývoja ascitu;
- nádoru a zdravých tkanív.
Princíp metódy prietokovej cytometrie
Zásady, ktoré sú základom cytometrického postupu, sú veľmi jednoduché.
suspenzie pripravenej z buniek vopred označených fluorescenčnými monoklonálne protilátky alebo fluorochrómy sa umiestni do prúdu dispergačného média, prenášané cez prietokovú komoru. Hydrodynamické zaostrovanie
bunkovej suspenzie prúd do prúdu dispergačného média vedie k tomu, že skúmané bunky alebo ich jadrá sú usporiadané jednotlivo a v tomto poradí priečny nosník zameriava svetlo( typicky laser) svetlo.
svetlo fluorochrómy, zamerané optickým systémom sa skladá z niekoľkých zrkadiel a šošoviek, a potom sa nanesie na určité súčasti.
prijaté svetelné signály sa analyzuje a konverzie na elektrické impulzy, a potom - v niektorých formách vhodných pre počítačové spracovanie a uloženie prijatej informácie.
Fluorochróm
Aby sa uľahčil proces určovania bunkových štruktúr počas postupu prietokovej cytometrie, použité disperzné médium sa zafarbilo špeciálnymi fluorescenčnými farbivami - fluorochrómami.
Po takomto ošetrení získavajú testované bunky schopnosť fluorescencie( svetla) pod vplyvom lúča svetelných lúčov.
Pri výbere farbiva sa používa niekoľko kritérií:
- Použitý fluorochróm musí byť špecifický pre vyšetrovanú DNA.
- Spektrálne charakteristiky farbiva musia zodpovedať funkciám použitého zariadenia.
- Dôležitým faktorom sú náklady na fluorochróm( nemal by byť veľmi vysoký).
- Použité farbivá by mali byť ľahko použiteľné( majú stabilitu a dobrú rozpustnosť).
Jedným z najobľúbenejších fluorochrómov je propidiumjodid: jeho spektrálne vlastnosti sú ideálne vhodné na vykonávanie prietokovej cytometrie.
Na aktiváciu fluorescencie pomocou propidiumjodidu sa vedci prihlásili na bežný argónový laser( jeho pracovná vlnová dĺžka je 480 nm).Oblasť fluorescenčnej sekcie je taká, že umožňuje použiť vyššie uvedený fluórchróm na vykonanie multiparametrových meraní.
Pre prietokovú cytometriu sa používa tiež:
- fluoresceín izotiokyanát;Phycoerytríny
- ( Cy5, Cy7, texan červená);
- alloficocyanin;
- Peridinín-chlorofylový proteín.
Bez ohľadu na to, aké farbivo je zahrnuté do postupu, jeho množstvo by malo byť priamo úmerné obsahu DNA v bunkovej štruktúre.
Aby sa dosiahlo kvalitatívne zafarbenie všetkých bunkových štruktúr, množstvo fluorochrómu musí byť nadmerné.
Väčšina fluórchrómov prichádzajúcich do styku s DNA nie je schopná prechádzať membránami intaktných( neporušených) buniek. Na zvýšenie priepustnosti bunkových membrán sa bunky, ktoré sú predmetom skúmania, ošetria povrchovo aktívnymi látkami( detergentmi) alebo alkoholom.
Výhody
nepochybné, môžu byť považované za výhody prietokovej cytometrie:
- vysoká( až sto tisíc epizód za sekundu) rýchlosť analýzy.
- Schopnosť určiť bunkové subpopulácie.
- Schopnosť vykonávať analýzu obrovského( až 108 prvkov v jednom ml disperzného média) počtu buniek.
- Schopnosť určiť parametre všetkých buniek a bunkových štruktúr( vrátane vzácnych).
- Vysoký stupeň objektívnosti pri meraní intenzity luminiscencie( fluorescencia).
Kde sa má uchádzať?
Spektrum aplikácie prietokovej cytometrie je neobvykle široké.Používa sa aj v priemysle na kontrolu výrobného procesu. Ukážeme to tak, že poskytneme informácie v podobe zoznamov, aby boli zrozumiteľnejšie.
V onkológii
V tejto časti medicíny sa prietoková cytometria používa na:
- kvantifikáciu intracelulárnych štruktúr( DNA);
- štúdium hlavných parametrov bunkového cyklu;
- identifikácia a počítanie buniek patriacich do rôznych periód bunkového cyklu;
- detekcia aneuploidných klonov( abnormálne bunky s neštandardným súborom chromozómov), čo naznačuje vývoj akútnej leukémie;
- , ktorý odhaľuje stupeň proliferačnej aktivity( tendencia k aktívnemu rozdeleniu) aneuploidných klonov;
- detekcia nádorových markerov;
- monitoruje stav ohrozených pacientov;
- hodnotí funkciu imunitného systému a funkčnú konzistenciu imunitných buniek;
- detekcia subpopulácií lymfocytov( táto vlastnosť umožňuje posúdiť stav imunity).
Video prietokovej cytometrie v diagnostike akútnej leukémie:
Immunology Prietoková cytometria umožňuje:
- na vykonanie imunofenotypizácie( určenie typu a funkčného stavu) krvných buniek;
- nastaviť fagocytárnu aktivitu imunitných buniek( uvedené zachytenie baktérií, označené fluorescenčné farbivá);
- identifikuje intracelulárne proteíny;
- určuje rozsah proliferačnej aktivity;
- na vyšetrenie fáz bunkového cyklu;
- posúdiť mieru cytotoxicity( ochranný mechanizmus zničiť subcelulárnu úrovni pre prvokmi, baktérie a vírusy) bunky. Cytológia
Prietoková cytometria poskytuje komplexné dáta:
- presne nastaviť cytomorphological akýchkoľvek buniek charakteristík( jeho veľkosť, úroveň asymetrie, pomer medzi jadrom a cytoplazmy);
- hodnotí aktivitu enzýmov, ktoré tvoria bunku;
- analyzuje fázy bunkového cyklu;
- meranie intracelulárnu fyziologické parametre( hodnoty pH, potenciálu bunkovej membrány, je koncentrácia voľných iónov).
hematológie pomocou prietokovej cytometrie môže hematológie:
- analyzovať subpopulácií krviniek;
- na počítanie počtu retikulocytov a krvných doštičiek pomocou špecifických markerov;
- vyhodnotí dôsledky reziduálnej( zostatkovej, nie úplne vyliečenej) choroby;
- diagnostikuje akútnu leukémiu;
- vykonať diferenciálnu diagnózu reaktívne lymfocytóza a lymfoproliferatívne ochorenia( ochorenie, pri ktorých sa napadnuté bunky, ktoré majú lymfoidné povahy);
- na diagnostiku ochorení lymfoproliferatívnej etiológie.
Pharmaceuticals
Prietoková cytometria umožňuje pharmacologists:
- nastaviť úroveň expresie( citlivosť nádorov rôznych lokalizáciách liečba liekmi) proteínových markerov;
- meria aktivitu enzýmov, ktoré tvoria bunky;
- zaoberajúca sa štúdiom pôsobenie bioaktívnych látok v stave tela ľudských buniek pre stanovenie akejkoľvek fáze bunkového cyklu.
poľnohospodárstvo
metóda prietokovej cytometrie je široko používaný vedci špecializujúca sa na šľachtenie nových šľachtenie rastlín a zvierat, ako tí na to umožňuje:
- určenie ploidii( počet identických chromozomálnych sád v jadre bunky);
- vykonáva analýzu akejkoľvek fázy bunkového cyklu;
- vykonávať analýzu obsahu protoplastov( bakteriálnych alebo rastlinných buniek), a triedenie ich výrobe podľa vopred stanovených parametrov.