Nicel sitometri, dağılma ortamının mikrobiyolojik incelenmesi için nispeten yeni bir teknik olup, özel ekipman yardımı ile gerçekleştirilir. Sitometri statik ve akıcıdır.
Statik sitometri, konfokal mikroskoplar kullanılarak yapılır;Bunların yokluğunda, hafif modifiye lüminesans mikroskoplar basit ve ucuz görüntü analiz sistemleri ile donatılmıştır.
Akım sitometrisi, özel cihazlar - sıralayıcı ve akış sitometrelerinde gerçekleştirilir.
Her iki nicel sitometri varyantı, tıbbi ve biyolojik araştırmalara uygulanmada mümkün olan en geniş uygulamaya sahiptir. Kullanılan klinik materyaldeki farklılığa ve deneysel modellere rağmen, çözdükleri görevler çalışma genel prensiplerine tabidir.
Akış sitometrisi nedir?sinyalleri dağılmış bir fazını içermektedir parçacıkların analiz dağılım modu SINGLER içinde technique çalışma maddeler sitometrisi
akış floresans ve ışık saçılımı alınan.
Flow sitometri tekniği, çalışılan parçacıkların boyutlarını belirlemek ve sayılarını saymak için özel deneyler temelinde geliştirildi.
ilk hücre sıralayıcı 1965 yılında kuruldu, ama önümüzdeki on yılın başından bu yana çalışılan hücrenin birden çok parametre belirlemek için birkaç dalga boylarında floresan yoğunlukları ölçmek için cihazların üretimini düzenlenmiştir.on( sözde küçük açılı ileri saçılma) doksan derecelik bir açı ile iki( veya daha fazla) dalga boyları ve ışık saçılımı de floresansı ölçmek için
- Instruments:
araçlar sitometri araştırmacılar modern akışı için iki tür kullanılmıştır. Bu tür aygıtlar kullanımı kolaydır.
- İncelenen çekirdeklerin veya parçacıkların beşten fazla parametresini ölçebilen ve aynı zamanda belirli parametreler grubuna sahip hücreleri sıralayabilen oldukça hantal hücre ayırıcılar.
cihazı gelişmiş akış sitometre hala var, tüm cihazlara ortak bir genelleme ve sistemli, ancak birkaç genel noktalar, zor o kadar karmaşık ve oldukça farklıdır: Herhangi bir tür sitometresinde analiz için
- belirli bir tip hücrelerin homojen bir süspansiyon gerekir.
- Hücrenin veya bunların çekirdeğinin sayısından hiçbir sıkıntısı olmamalıdır.
- Hücrelerin birbirine yapışmasını önlemek için, araştırmacı, ışığın dağılımının doğası hakkında tam bilgiye sahip olmalı ve eldeki ilgili verilere sahip tablolar içermelidir.
Örnekleri
Tıbbi ve biyolojik çalışmalar sırasında, hücrelerden hazırlanan örnekler:
- kemik iliği;
- kan;
- beyin omurilik sıvısı( CSF);
- sinovyal( eklem) sıvı;
- plevral sıvı;
- karın gelişimi sırasında karın boşluğunda biriken peritoneal( asit) sıvı;
- tümörü ve sağlıklı dokuları.
Flow sitometri yöntemi prensibi
Sitometrik prosedürün altında yatan ilkeler son derece basittir.
Daha önce flüoresan monoklonal antikorlar veya florokromlar ile etiketlenmiş hücrelerden hazırlanan bir süspansiyon, bir akış hücresi içinden geçirilen bir dispersiyon ortamı akışına yerleştirilir.dispersiyon ortamı akımı içine
hücre süspansiyonu jet odaklama Hidrodinamik incelenmiştir hücreler ya da çekirdekler, tek başlarına düzenlenir ve bu sırayla çapraz kiriş ışığı( tipik olarak lazer) ışık odaklanmış olmasına yol açar.fluorochromes gelen
ışık, çeşitli aynalar ve lensten oluşan bir optik sistem tarafından odaklanmış ve sonra belirli bileşenleri üzerinde yayıldı.
Alınan ışık sinyalleri, elektriksel darbeler için analiz ve dönüştürme işlemine tabi tutulur ve daha sonra alınan bilgilerin bilgisayar tarafından işlenmesi ve depolanması için kabul edilebilir bazı formlara dönüştürülür.
Florokromlar
Flow sitometri prosedürü sırasında hücresel yapıların saptanması sürecini kolaylaştırmak için, kullanılan dispersiyon ortamı özel flüoresan boyalar-florokromlar ile renklendirilir.
Bu tür muameleden sonra, test edilen hücreler, bir ışık ışınının ışığı altında fluoresans( ışık) yeteneği kazanırlar.
Bir boya seçerken bazı kriterler kullanılır:
- Kullanılan florokrom, araştırılan DNA'ya spesifik olmalıdır.
- Boya spektral özellikleri kullanılan ekipmanın özelliklerine uygun olmalıdır.
- Florokromun maliyeti önemli bir faktördür( çok yüksek olmamalıdır).
- Kullanılan boyaların kullanımı kolay olmalı( stabiliteye ve iyi çözünürlüğe sahip olmalıdır).
En popüler florokromlardan biri propidyum iyodürdür: spektral özellikleri akış sitometrisi gerçekleştirmek için idealdir.
Araştırmacılar, propidyum iyodür kullanarak flüoresanı etkinleştirmek için geleneksel bir argon lazer kullanmaktadır( çalışma dalga boyu 480 nm'dir).Flüoresan bölümünün alanı, yukarıda belirtilen florokromu, çok parametreli ölçümler yapmak için kullanmamızı sağlayacak şekildedir.
Akış sitometrisi için aşağıdakiler de kullanılır:
- fluorescein izotiosiyanat;
- fitoeritrinler( Cy5, Cy7, Texan kırmızısı);
- allofikosiyanin;
- Peridinin-Klorofil Proteini.
Prosedürde hangi boya katıldığına bakılmaksızın, miktarı hücre yapısındaki DNA içeriğiyle doğru orantılı olmalıdır.
Tüm hücresel yapıların niteliksel bir şekilde boyanabilmesi için kullanılan florokrom miktarı aşırı olmalıdır.
DNA ile temasa giren florokromların çoğu sağlam( bozulmamış) hücrelerin zarlarından geçemez. Hücre zarlarının geçirgenliğini arttırmak için incelenen hücreler yüzey aktif maddeler( deterjanlar) veya alkol ile işleme tabi tutulur.
Avantajları Akış sitometrisinin kuşkusuz avantajları düşünülebilir:
- Yüksek( saniyede yüz binin üzerine kadar) hız.
- Hücresel alt popülasyonları belirleme becerisi.
- Hücrelerin sayısının büyük bir analizini( bir dispersiyon ortamının bir ml'sinde 108 elemente kadar) yapma kabiliyeti.
- Herhangi bir hücrenin ve hücresel yapıların parametrelerini( nadir olanlar da dahil olmak üzere) belirleme becerisi.
- Lüminesans yoğunluğunun ölçülmesinde yüksek derecede objektiflik( floresan).
Nereye başvurabilirim?
Akış sitometrisinin uygulanma yelpazesi olağandışı genişliktedir.Üretim sürecini kontrol etmek için bile endüstride kullanılır. Bunu netlik için listeler şeklinde bilgi vererek göstereceğiz.
Onkoloji
Bu tıp bölümünde akış sitometrisi şu amaçlarla kullanılır:
- , hücre içi yapıları( DNA) nicelleştirir;
- hücre döngüsünün ana parametrelerini incelemek;
- hücre döngüsünün farklı periyotlarına ait hücrelerin tanımlanması ve sayımı;
- Akut löseminin gelişimini gösteren anöploid klonların saptanması( standart dışı kromozom setli anormal hücreler);
- aneuploid klonların proliferatif aktivitesinin( aktif bölünme eğilimi) derecesini açığa çıkarmak;
- tümör belirteçlerinin saptanması;
- , risk altındaki hastaların durumunu izlemek;
- , bağışıklık sisteminin işleyişini ve bağışıklık hücrelerinin işlevsel tutarlılığını değerlendirir;
- lenfosit alt popülasyonlarının saptanması( bu özellik bağışıklığın durumunu değerlendirmeye izin verir).
Akut Lösemi Tanısında Akım Sitometrisi Üzerine Video:
İmmunoloji
Akış sitometrisi yöntemi şunları sağlar:
- , kan hücrelerinin imünofenotiplendirmesini( tipli ve fonksiyonel durumu belirlemek için) gerçekleştirir;
- ( floresan boya ile işaretlenmiş belirtilen bakteriler yakalama) bağışıklık hücrelerinin fagositik aktivitesi ayarlamak;
- , hücreiçi proteinleri tanımlar;
- , proliferatif etkinliğin kapsamını belirler;
- , hücre döngüsünün evrelerini araştırmak;
- hücre( protozoon, bakteri ve virüsler için hücre altı düzeyde yok etmek koruyucu mekanizma) sitotoksisite derecesini değerlendirmek. Sitolojik
Akış sitometrisi için kapsamlı bir veri sağlar: doğru herhangi bir hücre özelliklerinin sitomorfolojik ayarlanmış
- ( boyutu, asimetri seviyesi, çekirdekte ve sitoplazmada arasındaki oran);
- , hücrenin oluşturduğu enzimlerin aktivitesini değerlendirir;
- , hücre döngüsünün evrelerini analiz eder;
- fizyolojik hücre içi parametrelerini ölçer( pH seviyesi, hücre zarı potansiyeli, serbest iyon konsantrasyonu).Akış sitometrisi ile
Hematoloji hematologların olabilir:
- kan hücrelerinin alt-popülasyonunu analiz etmek;
- , belirli belirteçlerin yardımıyla retikülosit ve trombosit sayısını saymak;
- kalıntıların( tamamen iyileşmemiş kalıntıların) sonuçlarını değerlendirir;
- akut lösemi teşhisi;
- ayırıcı tanı reaktif lenfosit ve lenfoid malignitelerin yerine( hastalıkları olan lenfoid doğaya sahip etkilenmiş hücreler);Lenfoproliferatif etyoloji hastalıklarını teşhis etmek için
- .
İlaç
Akış sitometrisi farmakologlar yardımcı olur:
- ekspresyon seviyesini protein belirteçleri( farklı noktasından tedavisi ilaçlar tümörlerin duyarlılığını) ayarlamak;
- , hücreleri oluşturan enzimlerin aktivitesini ölçer;
- herhangi bir hücre devre evresini belirlemek için insan hücrelerinin vücut durumuna biyoaktif maddelerin etkisini incelemek yapan.o sağlar gibi akış sitometrisi
tarım
yöntemi yaygın, yeni bitki ve hayvan ıslahının yetiştirme konusunda uzmanlaşmış bilim adamları tarafından kullanılır:
- ( çekirdekte aynı kromozom setlerinin sayısı) hücreleri ploidisi belirlemek;
- , hücre döngüsünün herhangi bir aşamasını analiz eder;
- protoplast( bakteriyel veya bitki hücreleri) içeriği analiz ve sıralama, önceden belirlenmiş parametrelere uygun olarak üretirler.