Die quantitative Zytometrie ist eine relativ neue Technik zur mikrobiologischen Untersuchung von Dispersionsmedien, die mit Hilfe spezieller Geräte durchgeführt wird. Die Zytometrie ist statisch und fließend.
Die statische Zytometrie wird mit konfokalen Mikroskopen durchgeführt;in Ermangelung von ihnen sind leicht modifizierte Lumineszenzmikroskope mit einfachen und billigen Bildanalysesystemen ausgestattet.
Die Durchflusszytometrie wird an speziellen Geräten - Sortier- und Durchflusszytometern - durchgeführt.
Beide Varianten der quantitativen Zytometrie haben die breitestmögliche Anwendung in der medizinischen und biologischen Forschung. Trotz des Unterschieds im verwendeten klinischen Material und der experimentellen Modelle unterliegen die Aufgaben, die sie lösen, den allgemeinen Prinzipien der Studie.
Was ist Durchflusszytometrie?
Die Durchflusszytometrie ist eine Technik zur Untersuchung von Dispersionssubstanzen im Modus der Stückanalyse von Partikeln, die einen Teil einer dispergierten Phase bilden, aus Signalen, die während der Fluoreszenz- und Lichtstreuung erhalten werden.
Die Durchflusszytometrietechnik wurde auf der Grundlage spezieller Experimente entwickelt, um die Größe der zu untersuchenden Teilchen zu bestimmen und ihre Anzahl zu zählen.
erster Zellsortierer wurde in 1965 Jahren geschaffen, aber seit Anfang des nächsten Jahrzehnts wurde zur Messung der Fluoreszenzintensitäten bei verschiedenen Wellenlängen mehrere Parameter der untersuchten Zelle bestimmen Produktion von Geräten angeordnet.zur Messung der Fluoreszenz bei zwei( oder mehr) Wellenlängen und die Lichtstreuung bei einem Winkel von zehn( die sogenannten Kleinwinkelvorwärtsstreuung) und neunzig Grad
- Instrumente:
für Forscher moderne Durchflusszytometrie Instrumente werden zwei Arten verwendet. Geräte dieser Art sind einfach zu bedienen.
- Ziemlich sperrige Zellsortierer, die mehr als fünf Parameter der untersuchten Kerne oder Partikel messen und auch Zellen mit bestimmten Parametern sortieren können.
Gerät erweiterte Durchflusszytometer sind so komplex und vielfältig, dass es zu einer Verallgemeinerung und Systematisierung schwierig, aber einige allgemeine Punkte, die für alle Geräte, besteht nach wie vor:
- Für die Analyse auf dem Durchflusszytometer jeglicher Art erfordert eine homogene Suspension von Zellen eines bestimmten Typs.
- Es sollte kein Mangel an Zellen oder deren Kernen geben.
- Um zu verhindern, dass die Zellen zusammenkleben, muss der Forscher vollständige Informationen über die Art der Lichtstreuung haben und Tabellen mit relevanten Daten zur Hand haben.
Proben
Während der medizinischen und biologischen Studien, Proben aus den Zellen:
- des Knochenmarks;
- Blut;
- Zerebrospinalflüssigkeit( CSF);
- der synovialen( Gelenk-) Flüssigkeit;
- Pleuraflüssigkeit;
- peritoneale( Aszites) Flüssigkeit, die sich während der Entwicklung von Aszites in der Bauchhöhle ansammelt;
- von Tumor und gesundem Gewebe.
Prinzip der Durchflusszytometrie
Die dem zytometrischen Verfahren zugrunde liegenden Prinzipien sind äußerst einfach.
Eine Suspension, die aus Zellen hergestellt wurde, die zuvor mit fluoreszierenden monoklonalen Antikörpern oder Fluorochromen markiert waren, wird in einen Strom eines Dispersionsmediums gegeben, das durch eine Fließzelle geleitet wird. Hydrodynamische
Zellsuspensionsstrahl in einen Strom des Dispersionsmediums Fokussierung führt zu der Tatsache, dass die untersuchten Zellen oder deren Kerne einzeln angeordnet sind und in dieser Reihenfolge Querträger fokussiert Licht( typischerweise Laser) Licht.
Das von den Fluorochromen ausgehende Licht wird mittels eines aus mehreren Spiegeln und Linsen bestehenden optischen Systems fokussiert und anschließend in spezifische Komponenten zerlegt.
Die empfangenen Lichtsignale werden einer Analyse und Umwandlung in elektrische Impulse und dann bestimmten Formen unterzogen, die für die Computerverarbeitung und Speicherung der empfangenen Information akzeptabel sind.
Fluorochrome
Um den Prozess der Bestimmung der zellulären Strukturen während des Durchflusszytometrieverfahrens zu erleichtern, wird das verwendete Dispersionsmedium mit speziellen Fluoreszenzfarbstoffen - Fluorochromen - gefärbt.
Nach einer solchen Behandlung erhalten die zu testenden Zellen die Fähigkeit, unter dem Einfluss eines Lichtstrahls zu fluoreszieren( Licht).
Bei der Auswahl eines Farbstoffs werden eine Reihe von Kriterien verwendet:
- Das verwendete Fluorochrom muss spezifisch für die zu untersuchende DNA sein.
- Die spektralen Eigenschaften des Farbstoffs müssen mit den Fähigkeiten der verwendeten Ausrüstung übereinstimmen.
- Ein wichtiger Faktor sind die Kosten von Fluorochrom( es sollte nicht sehr hoch sein).
- Die verwendeten Farbstoffe sollten einfach zu verwenden sein( Stabilität und gute Löslichkeit).
Eines der beliebtesten Fluorochrome ist Propidiumiodid: Seine spektralen Eigenschaften sind ideal für die Durchführung der Durchflusszytometrie geeignet.
Um die Fluoreszenz mit Propidiumiodid zu aktivieren, greifen die Forscher auf einen konventionellen Argonlaser zurück( seine Arbeitswellenlänge beträgt 480 nm).Die Fläche des fluoreszierenden Abschnitts ist derart, dass es uns ermöglicht, das oben erwähnte Fluorochrom zu verwenden, um Multiparametermessungen durchzuführen.
Für die Durchflusszytometrie wird auch Folgendes verwendet:
- Fluoresceinisothiocyanat;
- -Phycoerythrine( Cy5, Cy7, Texanrot);
- Alloficocyanin;
- Peridinin-Chlorophyll-Protein.
Unabhängig davon, welcher Farbstoff an dem Verfahren beteiligt ist, sollte seine Menge direkt proportional zum Gehalt an DNA in der Zellstruktur sein.
Um eine qualitative Färbung aller zellulären Strukturen zu erreichen, muss die Menge an verwendetem Fluorochrom zu hoch sein.
Die meisten Fluorochrome, die mit DNA in Kontakt kommen, können die Membranen intakter( intakter) Zellen nicht passieren. Um die Permeabilität der Zellmembranen zu erhöhen, werden die untersuchten Zellen mit Tensiden( Detergenzien) oder mit Alkohol behandelt.
Vorteile von
Die unbestrittenen Vorteile der Durchflusszytometrie können berücksichtigt werden:
- Hohe( bis zu hunderttausend Episoden pro Sekunde) Analysegeschwindigkeit.
- Fähigkeit, zelluläre Subpopulationen zu bestimmen.
- Die Fähigkeit, die Analyse einer großen Anzahl von Zellen( bis zu 108 Elemente in einem ml eines Dispersionsmediums) durchzuführen.
- Fähigkeit, die Parameter von irgendwelchen Zellen und Zellstrukturen( einschließlich seltener) zu bestimmen.
- Hohe Objektivität bei der Messung der Lumineszenzintensität( Fluoreszenz).
Wo bewerben?
Das Anwendungsspektrum der Durchflusszytometrie ist ungewöhnlich breit. Es wird sogar in der Industrie verwendet, um den Produktionsprozess zu kontrollieren. Wir werden dies demonstrieren, indem wir Informationen in Form von Listen zur Verdeutlichung bereitstellen.
In der Onkologie
In diesem Teil der Medizin wird die Durchflusszytometrie verwendet, um:
- intrazelluläre Strukturen( DNA) zu quantifizieren;
- Studie der wichtigsten Parameter des Zellzyklus;
- Identifizierung und Zählung von Zellen, die zu verschiedenen Perioden des Zellzyklus gehören;
- -Nachweis von aneuploiden Klonen( abnormale Zellen mit nicht-standardisiertem Chromosomensatz), was auf die Entwicklung von akuter Leukämie hinweist;
- , das den Grad der proliferativen Aktivität( Tendenz zur aktiven Teilung) von aneuploiden Klonen zeigt;
- Nachweis von Tumormarkern;
- Überwachung des Status von Risikopatienten;
- bewertet die Funktion des Immunsystems und die funktionelle Konsistenz von Immunzellen;
- Nachweis von Subpopulationen von Lymphozyten( diese Eigenschaft ermöglicht es, den Zustand der Immunität zu beurteilen).
Video auf Durchflusszytometrie in der Diagnose von akuter Leukämie:
Immunologie
Die Durchflusszytometrie-Methode ermöglicht:
- zur Durchführung einer Immunphänotypisierung( Bestimmung des Typs und des funktionellen Zustands) von Blutzellen;
- stellt die phagozytische Aktivität von Immunzellen her( dies wird durch Einfangen von Bakterien angezeigt, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind);
- identifizieren intrazelluläre Proteine;
- bestimmen das Ausmaß der proliferativen Aktivität;
- zur Untersuchung der Stadien des Zellzyklus;
- bewertet den Grad der Zytotoxizität( ein Schutzmechanismus, der die Zerstörung von Protozoen, Bakterien und Viren erlaubt) auf intrazellulärer Ebene. Zytologie
Fluss liefert Cytometry umfassende Daten an:
- genau eingestellt zytomorphologische beliebigen Zelleigenschaften( Größe, der Grad der Asymmetrie, wobei das Verhältnis zwischen dem Kern und Plasma);
- bewerten die Aktivität der Enzyme, aus denen die Zelle besteht;
- analysieren die Stadien des Zellzyklus;
- messen physiologische intrazelluläre Parameter( pH-Wert, Zellmembranpotential, Konzentration von freien Ionen).
Hämatologie
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie können Hämatologen:
- die Subpopulationszusammensetzung von Blutzellen analysieren;
- , um die Anzahl der Retikulozyten und Thrombozyten mit Hilfe spezifischer Marker zu bestimmen;
- bewerten die Folgen von Rest( Rest, nicht vollständig geheilt) Krankheit;
- diagnostiziert akute Leukämie;
- führen differentielle Diagnostik von reaktiven Lymphozytose und lymphoproliferativen Erkrankungen durch( Erkrankungen, bei denen Zellen mit lymphoidem Charakter betroffen sind);
- zur Diagnose von Erkrankungen der lymphoproliferativen Ätiologie.
Pharmakologie
Durchflusszytometrie hilft Pharmakologen:
- , das Niveau der Expression( Empfindlichkeit von Tumoren verschiedener Lokalisationen auf Drogenbehandlung) von Proteinmarkern zu bestimmen;
- messen die Aktivität von Enzymen, aus denen die Zellen bestehen;
- beschäftigt sich mit der Untersuchung der Wirkung von bioaktiven Substanzen auf den Zustand von Zellen des menschlichen Körpers, um jedes Stadium des Zellzyklus zu bestimmen.
Landwirtschaft
Verfahren der Durchflusszytometrie wird von Wissenschaftlern, spezialisiert auf die Züchtung neuer Pflanzen- und Tierzucht, wie es Ihnen erlaubt, weit verbreitet:
- Ploidie bestimmen( Anzahl identischer Chromosomensätze in den Kern-Zellen);
- führt eine Analyse von jedem Stadium des Zellzyklus durch;
- führt die Analyse des Inhalts von Protoplasten( Bakterien- oder Pflanzenzellen) durch und sortiert sie auch nach den eingestellten Parametern.