A mennyiségi citometria egy viszonylag új módszer a diszperziós közeg mikrobiológiai vizsgálatára, amelyet speciális berendezések segítségével végeznek el. A citometria statikus és folyékony.
A statikus citometria konfokális mikroszkóppal történik;ezek hiányában a kissé módosított lumineszcens mikroszkópok egyszerű és olcsó képelemző rendszerekkel vannak felszerelve.
Az áramlási citometriát speciális eszközökön - sorter és áramlásos citrométereken végezzük.
A kvantitatív citometria mindkét változata a lehető legszélesebb körben alkalmazható az orvosi és biológiai kutatás gyakorlatában. A használt klinikai anyag és a kísérleti modellek közötti különbség ellenére az általuk megoldott feladatok a tanulmány általános elvei alá tartoznak.
Mi az áramlási citometriás?
áramlási citometriával nevezett technikával tanulmány anyagok a diszperzióban módban Singler részecskék analizálására, amely tartalmazza a diszpergált fázis a vett jelek a fluoreszcencia és fényszórás.
Az áramlási citometriás technikát speciális kísérletek alapján fejlesztettük ki a vizsgált részecskék méretének meghatározása és számuk megszámolása céljából.
első sejtválogatót jött létre 1965-ben az évben, de mivel az elején a következő évtizedben rendezték termelés mérésére szolgáló eszközök fluoreszcenciaintenzitásokat több hullámhosszon, hogy meghatározzuk több paramétert a vizsgált sejtben.
kutatók Modern áramlási citometriával eszközöket használnak két típusa:
- nívó fluoreszcencia két( vagy több) hullámhosszon és fényszórásos szögben tíz( az úgynevezett kis szög előreszórás) és kilencven fokkal. Az ilyen eszközök könnyen használhatóak.
- meglehetősen nehézkes sejtosztályozó képes mérni több mint öt paraméterei a magok vagy a részecskék, valamint rendezni rendelkező sejtek a konkrét paraméterek.
készülék fejlett áramlási citométer annyira összetett és változatos, hogy nehéz olyan általánosítás és rendszerezése, de néhány általános pontot, közös az összes eszköz, továbbra is fennáll:
- analízishez a citométer bármilyen típusú igényel egy homogén szuszpenziót a sejtek egy bizonyos típusú.
- A sejtek vagy sejtmaguk számának hiányában nem szabad.
- Annak érdekében, hogy megakadályozzák a sejtek összeragasztását, a kutatónak teljes körű információval kell rendelkeznie a fényszóródás jellegéről, és rendelkeznie kell táblázatokkal a vonatkozó adatokkal.
minták
Az orvosi és biológiai vizsgálatok során a sejtekből előállított minták: csontvelő
- ;
- vér;
- cerebrospinális folyadék( CSF);Az synovial( ízületi) folyadék
- ;
- pleurális folyadék;
- peritoneális( ascites) folyadék halmozódik fel a hasüregben az ascites kialakulásának ideje alatt;
- daganat és egészséges szövetek.
Az áramlási citometriás módszer alapelve
A citometriai eljárás alapjául szolgáló elvek rendkívül egyszerűek.
szuszpenziók sejtekből készített pre-fluoreszcens monoklonális antitestekkel vagy fluorokrómok kerül az áramlás a diszperziós közeg, továbbított át az átáramlásos cellán. Hidrodinamikus fókuszálás
sejtszuszpenziót jet áramába a diszperziós közeg vezet az a tény, hogy a vizsgált sejteket vagy azok magok vannak elrendezve egyszeresen és ebben a sorrendben kereszttartóval fókuszált fényt( tipikusan lézer) fényt.
fény fluorokrómok, fókuszált optikai rendszer, amely több, tükröket és lencséket, majd elterjedt az egyes alkatrészeken.
kapott fényjeleket analizáljuk, és a konverziós elektromos impulzusok, majd - az egyes formái számítógépes feldolgozás számára alkalmasak és tárolására a vett információt.
Fluorokromok
Az áramlási citometriás eljárás során a sejtszerkezet meghatározásának megkönnyítése érdekében az alkalmazott diszperziós közeget speciális fluoreszcens festékekkel fluoreszkáljuk.
Az ilyen kezelést követően a vizsgált sejtek képesek fényt fluoreszkálni( light) egy fénysugár hatására.
A festék kiválasztásakor számos kritériumot alkalmaznak:
- A használt fluorokrómnak a vizsgált DNS-re specifikusnak kell lennie.
- A festék spektrális tulajdonságainak meg kell felelniük az alkalmazott berendezés képességeinek.
- Fontos tényező a fluorokróm költsége( nem lehet nagyon magas).
- A használt festékeknek könnyen használhatónak kell lenniük( stabilitás és jó oldhatóság).
Az egyik legnépszerűbb fluorokróm a propidium-jodid: spektrális jellemzői ideálisan alkalmasak az áramlási citometria elvégzésére.
A propidium-jodid alkalmazásával történő fluoreszcencia aktiválásához a kutatók hagyományos argonlézert használnak( működő hullámhossza 480 nm).A fluoreszkáló rész területe olyan, hogy lehetővé teszi számunkra a fent említett fluorokróm használatát több paraméteres mérések végrehajtásához.
Az áramlási citometriához a következőket is alkalmazzuk:
- fluoreszcein-izotiocianát;
- phycoerythrinek( Cy5, Cy7, Texan red);
- alloficocyanin;
- Peridinin-Klorofill Protein.
Függetlenül attól, hogy melyik festék részt vesz az eljárásban, annak mennyisége közvetlenül arányos a sejtszerkezet DNS-tartalmával.
Az összes sejtszerkezet minőségi festése érdekében az alkalmazott fluorokróm mennyiségének túlzottnak kell lennie.
A legtöbb DNS-vel érintkező fluorokróm nem képes áthatolni az érintetlen( ép) sejtek membránján. A sejtmembránok permeabilitásának növelése érdekében a vizsgált sejteket felületaktív anyagokkal( detergensekkel) vagy alkohollal kezeljük.
Az
előnyei Az áramlási citometria kétségtelen előnyei tekinthetők:
- Magas( akár százezer epizód másodpercenként) az analízis sebessége.
- A sejtpopulációk meghatározása.
- A sejtek számának hatalmas( legfeljebb 108 eleme egy ml diszperziós közegben) elemzése.
- Képes meghatározni minden sejt és sejtstruktúra paramétereit( beleértve a ritka is).
- Nagyfokú objektivitás a lumineszcencia intenzitás mérésében( fluoreszcencia).
Hol kell jelentkezni?
Az áramlási citometria alkalmazásának spektruma szokatlanul széles. A gyártási folyamatot az iparban is használják. Ezt bizonyítani fogjuk, ha tájékoztatást nyújtunk a listák formájában az egyértelműség érdekében.
Az onkológiában
A gyógyszer ezen szakaszában az áramlási citometriát használják:
- mennyiségi meghatározása intracelluláris struktúrák( DNS);
- tanulmány a sejtciklus főbb paramétereiről;
- azon sejtek azonosítása és számlálása, amelyek a sejtciklus különböző periódusaihoz tartoznak;
- aneuploid klónok kimutatása( kóros sejtek nem standard kromoszómakészletekkel), amelyek jelzik az akut leukémia kialakulását;
- , amely feltárja az aneuploid klónok proliferatív aktivitását( hajlamot az aktív osztódásra);
- tumor markerek detektálása;
- figyeli a veszélyeztetett betegek állapotát;Az
- értékeli az immunrendszer működését és az immunsejtek funkcionális konzisztenciáját;
- lymphocyták szubpopulációinak kimutatása( ez a jellemző lehetővé teszi a immunitás állapotának felmérését).
Videó az áramlási citometriával az akut leukémia diagnózisában:
Immunológia
Az áramlási citometriás módszer lehetővé teszi:
- a vérsejtek immunfenotipizálására( meghatározza a típusát és a funkcionális állapotát);Az
- létrehozza az immunsejtek fagocitikus aktivitását( ezt jelzi a fluoreszcens festékekkel jelölt baktériumok befogása);Az
- azonosítja az intracelluláris fehérjéket;Az
- határozza meg a proliferatív aktivitás mértékét;
- a sejtciklus szakaszainak vizsgálatára;Az
- értékeli a citotoxicitás mértékét( protézisek, baktériumok és vírusok megsemmisítését lehetővé tevő védőmechanizmus) intracelluláris szinten. Citológia
Áramlási citometria átfogó adatokat, hogy:
- pontosabban állítsuk citomorfológiai bármilyen sejt jellemzők( a mérete, a mértékű aszimmetria, közötti arány a sejtmagban és a citoplazmában);Az
- értékeli a sejtet alkotó enzimek aktivitását;
- elemzi a sejtciklus szakaszait;Az
- mérik a fiziológiás intracelluláris paramétereket( pH-szint, sejtmembránpotenciál, szabad ionok koncentrációja).
Hematológia áramlási citometriával lehet Hematológusok:
- elemzik a vérsejtek alfajai;
- a retikulocyták és a vérlemezkék számának megadására specifikus markerek segítségével;Az
- értékeli a maradék( maradék, nem teljesen gyógyult) betegség következményeit;
- akut leukémia diagnosztizálása;
- végre egy differenciáldiagnózis reakcióképes lymphocytosis és limfoproliferatív betegségek( betegségek, amelyekben az érintett sejtek, amelyek limfoid jellege);
- a limfoproliferatív etiológiák betegségeinek diagnosztizálására.
Pharmaceuticals
Áramlási citometria segít farmakológus:
- meghatározott expressziós szintje( érzékenysége daganatok különböző lokalizációt kezelés gyógyszerek) fehérje markerek;Az
- mérni tudja a sejteket alkotó enzimek aktivitását;Az
- foglalkozott a bioaktív anyagok hatásának tanulmányozásával az emberi test sejtjeinek állapotával a sejtciklus bármely szakaszának meghatározására.
mezőgazdaság
eljárás áramlási citometriával széles körben használják a tudósok szakosodott a tenyésztési új növény- és állattenyésztés, mivel lehetővé teszi, hogy:
- meghatározására ploidia( több azonos kromoszóma készlet a sejtmagban) sejtek;
- elvégzi a sejtciklus bármely szakaszának elemzését;Az
- elvégzi a protoplasztok( bakteriális vagy növényi sejtek) tartalmának elemzését, és a beállított paramétereknek megfelelően rendezi azokat.