Kuantitatif kuantitatif adalah teknik yang relatif baru untuk penyelidikan mikrobiologi media dispersi, dilakukan dengan bantuan peralatan khusus. Sitometri statis dan mengalir.
Sitometri statis dilakukan dengan menggunakan mikroskop confocal;Dengan tidak adanya, mikroskop luminescent yang sedikit dimodifikasi dilengkapi dengan sistem analisis citra sederhana dan murah.
Flow cytometry dilakukan pada alat khusus - sorter dan flow cytrometers.
Kedua varian dari sitometri kuantitatif memiliki aplikasi seluas mungkin dalam praktik penelitian medis dan biologi. Terlepas dari perbedaan dalam materi klinis yang digunakan dan model eksperimen, tugas yang mereka selesaikan tunduk pada prinsip umum penelitian ini.
Apa itu flow cytometry?
Flow cytometry adalah teknik untuk mempelajari zat dispersi dalam mode analisis sepotong partikel yang merupakan bagian dari fase terdispersi dari sinyal yang diperoleh selama fluoresensi dan hamburan cahaya.
Teknik flow cytometry dikembangkan berdasarkan percobaan khusus untuk menentukan ukuran partikel yang diteliti dan menghitung jumlahnya.
Penyortir sel pertama diciptakan pada tahun 1965, dan sejak awal dekade berikutnya, produksi instrumen yang dirancang untuk mengukur intensitas fluoresensi pada beberapa panjang gelombang dibentuk untuk menentukan beberapa parameter sel yang diteliti.
Periset modern menggunakan dua jenis instrumen untuk flow cytometry: Perangkat
- yang dirancang untuk mengukur fluoresensi pada dua( atau lebih) panjang gelombang dan cahaya yang tersebar pada sudut sepuluh( yang disebut hamburan langsung sudut kecil) dan sembilan puluh derajat. Perangkat jenis ini mudah digunakan.
- Penyortir sel rumit yang dapat mengukur lebih dari lima parameter inti atau partikel yang diteliti, dan juga mengurutkan sel yang memiliki seperangkat parameter tertentu.
Perancangan cytometers aliran modern sangat kompleks dan bervariasi sehingga sulit untuk digeneralisasi dan di sistematisasi, namun ada beberapa poin umum yang umum untuk semua perangkat:
- Penangguhan sel yang homogen terhadap jenis tertentu diperlukan untuk semua jenis analisis cytometer.
- Seharusnya tidak ada kekurangan jumlah sel atau nukleusnya.
- Untuk mencegah agar sel tidak saling menempel, peneliti harus memiliki informasi lengkap tentang sifat hamburan cahaya dan memiliki tabel dengan data yang relevan.
Sampel
Selama studi medis dan biologi, sampel disiapkan dari sel:
- sumsum tulang;Darah
- ;Cairan serebrospinal
- ( CSF);
- cairan sinovial( artikular);Cairan pleura
- ;
- peritoneal( asites) menumpuk cairan di rongga perut selama perkembangan asites;
- tumor dan jaringan sehat.
Prinsip metode flow cytometry
Prinsip-prinsip yang mendasari prosedur cytometric sangat sederhana.
Suspensi yang dibuat dari sel yang sebelumnya diberi label dengan antibodi monoklonal neon atau fluorochromes ditempatkan dalam aliran media dispersi yang melewati sel aliran.
Hidrodinamika yang memusatkan perhatian pada jet suspensi sel dalam jet medium dispersi mengarah pada fakta bahwa sel atau inti mereka yang diteliti selaras satu per satu dan dalam urutan ini menyilangkan sinar sinar terfokus( biasanya sinar laser).Lampu yang terpancar dari fluorochrom difokuskan dengan menggunakan sistem optik yang terdiri dari beberapa cermin dan lensa, kemudian didekomposisi menjadi beberapa komponen tertentu.
Sinyal cahaya yang diterima dikenai analisis dan transformasi menjadi pulsa listrik, dan kemudian ke bentuk-bentuk tertentu dapat diterima untuk pemrosesan dan penyimpanan informasi yang diterima.
Fluorochromes
Untuk memudahkan proses penentuan struktur seluler selama prosedur flow cytometry, media dispersi yang digunakan diwarnai dengan pewarna fluorochromes fluorescent khusus.
Setelah perawatan tersebut, sel yang diuji memperoleh kemampuan untuk berpendar( cahaya) di bawah pengaruh sinar sinar cahaya.
Saat memilih pewarna, sejumlah kriteria digunakan:
- Fluorochrome yang digunakan harus spesifik untuk DNA yang sedang diselidiki.
- Karakteristik spektral zat warna harus sesuai dengan kemampuan peralatan yang digunakan.
- Faktor penting adalah biaya fluorochrome( seharusnya tidak terlalu tinggi).
- Pewarna yang digunakan harus mudah digunakan( memiliki stabilitas dan kelarutan yang baik).
Salah satu fluorochromes yang paling populer adalah propidium iodide: karakteristik spektralnya sangat ideal untuk melakukan flow cytometry.
Untuk mengaktifkan fluoresensi menggunakan propidium iodide, periset menggunakan laser argon konvensional( panjang gelombang kerjanya adalah 480 nm).Area bagian fluoresen sedemikian rupa sehingga memungkinkan kita untuk menggunakan fluorochrome yang disebutkan di atas untuk melakukan pengukuran multi-parameter.
Untuk flow cytometry, berikut ini juga digunakan:
- fluorescein isothiocyanate;
- phycoerythrins( Cy5, Cy7, Texas red);
- alloficocyanin;Protein Peridinine-Klorofil
- .
Terlepas dari pewarna mana yang terlibat dalam prosedur ini, jumlahnya harus berbanding lurus dengan kandungan DNA dalam struktur sel.
Untuk mencapai pewarnaan kualitatif semua struktur seluler, jumlah fluorochrome yang digunakan harus berlebihan.
Kebanyakan fluorochromes yang bersentuhan dengan DNA tidak dapat melewati selaput utuh( utuh).Untuk meningkatkan permeabilitas selaput sel, sel yang diselidiki diobati dengan surfaktan( deterjen) atau dengan alkohol.
Keuntungan
Keuntungan yang tak diragukan lagi dari flow cytometry dapat dipertimbangkan:
- Tinggi( sampai seratus ribu episode per detik) kecepatan analisis.
- Kemampuan untuk menentukan subpopulasi seluler.
- Kemampuan untuk melakukan analisis besar( sampai 108 elemen dalam satu ml media dispersi) dari jumlah sel.
- Kemampuan untuk menentukan parameter dari setiap sel dan struktur seluler( termasuk yang langka).
- Tingkat objektivitas yang tinggi dalam pengukuran intensitas luminesensi( fluoresensi).
Dimana bisa mendaftar?
Spektrum penerapan flow cytometry sangat luas. Hal ini digunakan bahkan di industri untuk mengendalikan proses produksi. Kami akan menunjukkan ini dengan memberikan informasi dalam bentuk daftar untuk kejelasan.
Dalam onkologi
Dalam bagian kedokteran ini, flow cytometry digunakan untuk:
- mengukur struktur intraselular( DNA);
- mempelajari parameter utama dari siklus sel;Identifikasi
- dan penghitungan sel yang termasuk dalam periode siklus sel yang berbeda;
- mendeteksi klon aneuploid( sel abnormal dengan kromosom non-standar), menunjukkan perkembangan leukemia akut;
- mengungkapkan tingkat aktivitas proliferatif( kecenderungan pembagian aktif) klon aneuploid;Deteksi
- dari penanda tumor;
- memantau status pasien yang berisiko;
- menilai fungsi sistem kekebalan tubuh dan konsistensi fungsional sel kekebalan;
- mendeteksi subpopulasi limfosit( karakteristik ini memungkinkan untuk menilai keadaan kekebalan tubuh).
Video on Flow Cytometry dalam Diagnosis Leukemia Akut:
Imunologi
Metode flow cytometry memungkinkan:
- untuk melakukan imunophenotyping( menentukan tipe dan keadaan fungsional) sel darah;
- menetapkan aktivitas fagositik sel kekebalan( ini ditunjukkan oleh penangkapan bakteri yang diberi label dengan pewarna fluorescent);
- mengidentifikasi protein intraselular;
- menentukan tingkat aktivitas proliferatif;
- untuk menyelidiki tahapan siklus sel;
- menilai tingkat sitotoksisitas( mekanisme pelindung yang memungkinkan penghancuran protozoa, bakteri dan virus) pada tingkat intraselular. Sitologi
Flow cytometry menyediakan data komprehensif yang memungkinkan:
- untuk secara tidak jelas membentuk karakteristik sitomorfologi dari setiap sel( ukuran, tingkat asimetris, korelasi antara nukleus dan sitoplasma);
- mengevaluasi aktivitas enzim yang membentuk sel;
- menganalisis tahapan siklus sel;
- mengukur parameter intraselular fisiologis( tingkat pH, potensi membran sel, konsentrasi ion bebas).
Hematologi
Dengan bantuan flow cytometry, ahli hematologi dapat:
- menganalisis komposisi subpopulasi sel darah;
- untuk menghitung jumlah retikulosit dan trombosit dengan bantuan penanda spesifik;
- menilai konsekuensi dari penyakit sisa( sisa, tidak sepenuhnya sembuh);
- mendiagnosis leukemia akut;
- melakukan diagnosa diferensial dari limfositosis reaktif dan penyakit limfoproliferatif( penyakit dimana sel-sel dengan sifat limfoid terpengaruh);
- untuk mendiagnosis penyakit etiologi limfoproliferatif.
Farmakologi
Flow cytometry membantu ahli farmakologi:
- untuk menetapkan tingkat ekspresi( sensitivitas tumor lokalisasi yang berbeda terhadap pengobatan obat) dari spidol protein;
- mengukur aktivitas enzim yang membentuk sel;
- terlibat dalam penelitian tentang tindakan zat bioaktif pada keadaan sel tubuh manusia, untuk menentukan tahap siklus sel.
Pertanian
Metode aliran cytometry secara aktif digunakan oleh para ilmuwan yang mengkhususkan diri dalam pengembangan spesies tanaman baru dan breed breed ternak, karena memungkinkan:
- untuk menentukan ploidy( jumlah rangkaian kromosom identik dalam nukleus) sel;
- melakukan analisis terhadap setiap tahap siklus sel;
- melakukan analisis kandungan protoplas( bakteri atau sel tanaman), dan juga mengurutkannya sesuai dengan parameter yang ditetapkan.