Kvantitatīvā citometriskā - salīdzinoši jauna metode mikrobioloģiskās pārbaudes dispersijas mediju, ko veic, izmantojot speciālu aprīkojumu. Citometrija ir statiska un plūstoša.
statiskā citometriskā veikta izmantojot confocal mikroskopiju;viņu prombūtnes gaitā ir nedaudz pārveidots fluorescences mikroskopu, kas aprīkoti ar vienkāršu un zemu izmaksu attēla analīzes sistēmu.
Flow citometriskā tiek veikta speciālām ierīcēm - Šķirotājs un plūsmas tsitrometrah.
Gan kvantitatīvi citometriskā ir iespējami plašāku izmantošanu praksē medicīnas un bioloģisko pētījumu. Neskatoties uz atšķirību klīniskā materiāla un izmanto eksperimentāliem modeļiem to uzdevumu vispārējiem principiem pētījuma regulē.
Kas ir plūsmas citometrija?
plūsmas citometrijas metodi, ko sauc mācību vielu dispersijas režīmā singler analizējot daļiņas, kas satur ar fragmentāru fāzi saņemtajiem signāliem pie fluorescences un gaismas izkliedes.
Metodes Flow citometriskā tika izveidota, pamatojoties uz konkrētiem eksperimentiem, lai noteiktu izmēru daļiņu saskaņā ar pētījumu, un skaitīt to skaitu.
pirmo šūnu šķirotājs tika izveidota 1965. gadā, bet kopš nākamajā desmitgadē tika organizēta ražošanu ierīču mērīšanai fluorescences intensitātes vairākos viļņu garumos, lai noteiktu vairākus parametrus pētīto šūnā.
Pētnieku Modern plūsmas citometrijas instrumenti tiek izmantoti divu veidu:
- instrumenti mērīšanai fluorescences pēc diviem( vai vairāk), viļņu garumiem un gaismas izkliede leņķī desmit( tā sauktā mazā leņķa priekšu izkliede), un deviņdesmit grādiem.Šāda veida ierīces ir viegli lietojamas.
- diezgan apgrūtinoša šūna šķirotājs, kas spēj mērīt vairāk nekā piecus parametrus kodolu vai daļiņām, un arī lai sakārtotu šūnas, kurām piemīt specifisks parametru.
ierīce uzlabotas plūsmas cytometers ir tik sarežģīta un daudzveidīga, ka ir grūti jebkuram vispārinājums un sistematizēšanu, bet ar dažiem vispārīgiem jautājumiem, kas kopīgi visām ierīcēm, joprojām pastāv:
- analīzei par citometrs jebkāda veida nepieciešama homogēnu suspensiju šūnu noteikta veida.
- Nav jābūt trūkums skaita testa šūnu vai kodoliem.
- Lai novērstu salipšanu šūnu, pētniekam jābūt pilnīga informācija par dabu gaismas izkliede un ir uz rokām tabula ar attiecīgajiem datiem. Paraugi
Medicīnisko un bioloģisko pētījumu studiju paraugus, kas gatavoti no šūnas laikā:
- kaulu smadzenēs;
- asinis;
- cerebrospinālais šķidrums( CSF);Asinsvadu( locītavu) šķidruma
- ;
- pleiras šķidrums;
- peritoneālo( ascīts) no šķidruma uzkrāšanos vēdera dobumā, kas ascīti attīstības procesā;
- audzēja un veselīgu audu.
princips plūsmas citometrijas metodi
principiem, citometriskā procedūru pamatā ir ļoti vienkārša.
suspensijas, kas izgatavotas no šūnām pre-marķēti ar luminiscences monoklonālo antivielu vai fluorhromiem ir novietots plūsmā dispersijas nesēja, kas tiek nosūtīta ar plūsmas šūnā.Hidrodinamiskā fokusēšanas
šūnu suspensija strūklu straumē dispersijas nesēja izraisa to, ka izmeklētie šūnas vai to kodolus sakārtoti atsevišķi un šādā secībā šķērssijas vērsta gaismu( tipiski lāzera) gaismu.
gaisma no fluorhromiem, vērsta ar optisko sistēmu, kas sastāv no vairākām spoguļiem un lēcas, un pēc tam izplatījās uz dažām detaļām.
saņemto gaismas signāli tiek analizēts un pārvēršanu elektrisko impulsu, un pēc tam - uz noteiktu formu, kas piemērotas datu apstrādei un uzglabāšanai saņemto informāciju.
fluorohromi
Lai atvieglotu šūnu struktūras noteikšanas procesu plūsmas citometrijas procesā, izmantotais dispersijas līdzeklis ir tonēts ar īpašām fluorescējošām krāsām - fluorohromiem.
Pēc šādas apstrādes pārbaudāmās šūnas iegūst spēju fluorescē( gaismas) gaismas staru gaismas staru ietekmē.
Izvēloties krāsvielu, tiek izmantoti vairāki kritēriji:
- Izmantotajam fluorokrāmam jābūt specifiskam attiecībā uz izmeklējamo DNS.
- Krāsas spektrālajām īpašībām jāatbilst izmantoto iekārtu iespējām.
- Svarīgs faktors ir fluorohroma( tas nedrīkst būt ļoti augsts) izmaksas.
- Izmantotajām krāsvielām ir jābūt viegli lietojamām( tām ir stabilitāte un laba šķīdība).
Viens no populārākajiem fluorohromiem ir propidium jodīds: tā spektrālās īpašības ir ideāli piemērotas plūsmas citometrijas veikšanai.
Lai aktivizētu fluorescenci, izmantojot propidium jodīdu, pētnieki izmanto tradicionālo argona lāzeru( tā darba viļņa garums ir 480 nm).Luminiscences sekcijas laukums ir tāds, ka tas ļauj mums izmantot iepriekšminēto fluorohromu, lai veiktu vairāku parametru mērījumus.
Izmantojot plūsmas citometriju, izmanto arī:
- fluoresceīna izotiocianātu;
- fikoeritrīni( Cy5, Cy7, Texan sarkans);
- alloficocyanin;
- peridīn-hlorofila olbaltumviela.
Neatkarīgi no tā, kura krāsviela ir iesaistīta procedūrā, tā daudzumam jābūt tieši proporcionālam DNS saturam šūnu struktūrā.
Lai panāktu kvalitatīvu visu šūnu struktūru iekrāsošanu, izmantotajam fluorohromam jābūt pārmērīgam.
Lielākā daļa fluorohromu, kas nonāk saskarē ar DNS, nespēj iet caur neskartu( veselu) šūnu membrānām. Lai palielinātu šūnu membrānu caurlaidību, pētāmās šūnas tiek apstrādātas ar virsmaktīvām vielām( mazgāšanas līdzekļiem) vai ar spirtu.
Priekšrocības
Nepārprotamas plūsmas citometrijas priekšrocības var uzskatīt:
- High( līdz simts tūkstošiem epizodi sekundē) analīzes ātrums.
- Spēja noteikt šūnu apakšgrupas.
- Spēja veikt milzīgu( līdz 108 elementu vienā ml dispersijas vidē) analīzi no šūnu skaita.
- Spēja noteikt jebkuras šūnu un šūnu struktūru parametrus( arī retos gadījumos).
- Augsta objektivitātes pakāpe luminiscences intensitātes mērījumos( fluorescence).
Kur pieteikties?
Plūsmas citometrijas pielietošanas spektrs ir neparasti plašs. To pat izmanto rūpniecībā, lai kontrolētu ražošanas procesu. Mēs to parādīsim, skaidrības nodrošināšanai piedāvājot informāciju sarakstos.
Onkoloģijā
Šajā nodaļā zāļu caurplūsmas citometrija tiek lietota, lai:
- kvantitatīvi noteiktu intracelulārās struktūras( DNS);
- pētījums par šūnu cikla galvenajiem parametriem;
- šūnu identifikācija un skaitīšana, kas pieder dažādiem šūnu cikla periodiem;
- aneuploīdu klonu noteikšana( patoloģiskas šūnas ar nestandarta hromosomu komplektu), kas liecina par akūtas leikēmijas attīstību;
- , atklājot aneuploīdu klonu proliferācijas aktivitātes pakāpi( tendence uz aktīvo sadalījumu);
- audzēja marķieru atklāšana;
- riska grupas pacientu statusa uzraudzība;
- novērtē imūnsistēmas darbību un imūnās šūnu funkcionālo konsistenci;
- limfocītu subpopulāciju noteikšana( šī īpašība ļauj novērtēt imunitātes stāvokli).
video par plūsmas citometriju akūtas leikēmijas diagnostikā:
imunoloģija
Plūsmas citometrijas metode ļauj:
- veikt asins šūnu imūnfenotipēšanu( nosaka veidu un funkcionālo stāvokli);
- noteikts fagocītu aktivitāti imūnās šūnas( norādītā baktēriju uztveršanai, kas marķēti ar luminiscences krāsām);
- identificē intracelulārās olbaltumvielas;
- nosaka proliferācijas aktivitātes apjomu;
- , lai pētītu šūnas cikla posmus;
- novērtētu pakāpi citotoksicitātes( aizsardzības mehānismu, lai iznīcinātu subcellular līmeni uz vienšūņi, baktērijas un vīrusi) šūnā.Citoloģija
Flow citometriskā sniedz visaptverošus datus:
- precīzi noteikt cytomorphological jebkuru šūnu parametriem( tās lielumu, līmenis asimetrijas, attiecība starp kodolu un citoplazmu);
- novērtē fermentu aktivitāti, kas veido šūnu;
- analizē šūnas cikla posmus;
- nosaka fizioloģiskos intracelulārus parametrus( pH līmeni, šūnu membrānas potenciālu, brīvo jonu koncentrāciju).
Hematology ar plūsmas citometriju var hematologi:
- analizēt subpopulācijas asins šūnu;
- , lai noteiktu retikulocītu un trombocītu skaitu, izmantojot īpašus marķierus;
- novērtē atlikušās( atlikušās, nevis pilnībā izārstētās) slimības sekas;
- diagnosticē akūtu leikēmiju;
- veikt diferenciāldiagnostikas reaktīvo limfocitozi un limfoproliferācijas slimības( slimību, kuras skar šūnas, kurām limfātisko raksturu);
- , lai diagnosticētu limfoproliferatīvās etioloģijas slimības.
farmācija
Flow citometriskā palīdz farmakologu:
- noteikt izteiksmes līmeni( jutību audzēju dažādu lokalizāciju ārstēšanas medikamentu) proteīna marķieriem;
- novērtē fermentu aktivitāti, kas veido šūnas;
- iesaistīti pētot darbību bioloģiski aktīvo vielu ķermeņa stāvokļa cilvēka šūnu, lai noteiktu jebkuru šūnu cikla posmu.
lauksaimniecība
metode plūsmas citometriju zinātniekiem, kas specializējas selekcijas jaunu augu un dzīvnieku audzēšanai ir plaši izmantots, jo tas ļauj jums, lai:
- noteikt ploiditāti( identisku hromosomu komplekti kodolā) šūnas;
- analizēt jebkuru stadiju šūnas cikla;
- veikt satura analīzi protoplasts( baktēriju vai augu šūnas), un šķirošanas ražot tos saskaņā ar iepriekš noteiktiem parametriem.