Kwantitatieve cytometrie is een relatief nieuwe techniek voor microbiologisch onderzoek van dispersiemedia, uitgevoerd met behulp van speciale apparatuur. Cytometrie is statisch en vloeiend.
Statische cytometrie wordt uitgevoerd met behulp van confocale microscopen;bij afwezigheid zijn licht gemodificeerde luminescentiemicroscopen uitgerust met eenvoudige en goedkope beeldanalysesystemen.
Flowcytometrie wordt uitgevoerd op speciale apparaten - sorteer- en flowcytrometers.
Beide varianten van kwantitatieve cytometrie hebben de breedst mogelijke toepassing in de praktijk van medisch en biologisch onderzoek. Ondanks het verschil in het gebruikte klinische materiaal en de experimentele modellen, zijn de taken die ze oplossen onderworpen aan de algemene principes van het onderzoek.
Wat is flowcytometrie?
flowcytometrie techniek genoemd onderzoek stoffen in de dispersie modus singler analyseren deeltjes die de gedispergeerde fase van de ontvangen signalen de fluorescentie en lichtverstrooiing.
De flowcytometrietechniek werd ontwikkeld op basis van speciale experimenten om de grootte van de te bestuderen deeltjes te bepalen en hun aantal te tellen.
eerste cel sorter werd opgericht in 1965 jaar, maar sinds het begin van het volgende decennium werd aangebracht vervaardiging van inrichtingen voor het meten van fluorescentie-intensiteiten bij verschillende golflengten om verschillende parameters van de bestudeerde cel te bepalen.
onderzoekers Modern flowcytometrie instrumenten gebruikt twee typen:
- Instrumenten voor het meten van fluorescentie bij twee( of meer) golflengtes en lichtverstrooiing onder een hoek van tien( het zogenoemde kleine hoek voorwaartse verstrooiing) negentig graden. Apparaten van dit type zijn gemakkelijk te gebruiken.
- Vrij omslachtige celsorteerders die meer dan vijf parameters van de onderzochte kernen of deeltjes kunnen meten, en ook cellen sorteren die een bepaalde set parameters hebben.
inrichting advanced flowcytometers zo complex en divers dat het moeilijk een generalisatie en systematisering, maar enkele algemene opmerkingen, gemeenschappelijk voor alle apparaten, bestaat nog steeds:
- Voor analyse van de cytometer van elk type vereist een homogene suspensie van cellen van een bepaald type.
- Er mag geen tekort zijn aan het aantal cellen of hun kernen.
- Om te voorkomen dat de cellen aan elkaar plakken, moet de onderzoeker volledige informatie hebben over de aard van de verstrooiing van licht en tabellen hebben met relevante gegevens bij de hand.
Monsters
Tijdens medische en biologische studies, monsters bereid uit cellen:
- van beenmerg;
- -bloed;
- cerebrospinale vloeistof( CSF);
- van het synoviale( gewrichtsvloeistof);
- pleuravocht;
- peritoneale( ascites) vloeistof die zich ophoopt in de buikholte tijdens de ontwikkeling van ascites;
- van tumor en gezonde weefsels.
Principe van de flowcytometrie-methode
De principes die ten grondslag liggen aan de cytometrische procedure zijn uiterst eenvoudig.
suspensies bereid uit cellen voorgeïncubeerd gelabeld met fluorescerende monoklonale antilichamen of fluorochromen is geplaatst in de stroom van het dispersiemedium, doorgelaten door de stromingscel. Hydrodynamische focusing
celsuspensie straal in een stroom van het dispersiemedium leidt tot het feit dat de onderzochte cellen en hun kernen afzonderlijk zijn aangebracht en in deze volgorde dwarsbalk gericht licht( gewoonlijk laser) licht.
Het licht dat afkomstig is van de fluorochromen wordt gefocusseerd door middel van een optisch systeem dat bestaat uit verschillende spiegels en lenzen en vervolgens wordt ontbonden in specifieke componenten.
De ontvangen lichtsignalen worden onderworpen aan analyse en transformatie in elektrische pulsen en vervolgens aan bepaalde vormen die aanvaardbaar zijn voor computerverwerking en opslag van de ontvangen informatie.
Fluorochromen
Om het proces van het bepalen van de cellulaire structuren tijdens de flowcytometrieprocedure te vergemakkelijken, wordt het gebruikte dispersiemedium getint met speciale fluorescente kleurstoffen - fluorochromen.
Na een dergelijke behandeling krijgen de geteste cellen het vermogen om te fluoresceren( licht) onder invloed van een bundel lichtstralen.
Bij het kiezen van een kleurstof worden een aantal criteria gebruikt:
- Het gebruikte fluorochroom moet specifiek zijn voor het onderzochte DNA.
- De spectrale eigenschappen van de kleurstof moeten overeenkomen met de mogelijkheden van de gebruikte apparatuur.
- Een belangrijke factor is de kostprijs van fluorochroom( het mag niet erg hoog zijn).
- De gebruikte kleurstoffen moeten gemakkelijk te gebruiken zijn( stabiliteit hebben en goed oplosbaar zijn).
Een van de meest populaire fluorochromen is propidiumjodide: de spectrale eigenschappen ervan zijn bij uitstek geschikt voor het uitvoeren van flowcytometrie.
Om de fluorescentie te activeren met propidiumjodide, nemen onderzoekers hun toevlucht tot een conventionele argonlaser( zijn werkgolflengte is 480 nm).Het gebied van het fluorescerende gedeelte is zodanig dat het ons in staat stelt om het hierboven genoemde fluorochroom te gebruiken om metingen met meerdere parameters uit te voeren.
Voor flowcytometrie wordt ook het volgende gebruikt:
- fluoresceïne isothiocyanaat;
- fycoerythrins( Cy5, Cy7, Texan rood);
- alloficocyanine;
- Peridinine-chlorofyl-eiwit.
Ongeacht welke kleurstof betrokken is bij de procedure, moet de hoeveelheid ervan recht evenredig zijn met het DNA-gehalte in de celstructuur.
Om een kwalitatieve kleuring van alle cellulaire structuren te bereiken, moet de hoeveelheid gebruikt fluorochroom te groot zijn.
De meeste fluorochromen die in contact komen met DNA zijn niet in staat om door de membranen van intacte( intacte) cellen te passeren. Om de doorlaatbaarheid van celmembranen te vergroten, worden de cellen die worden onderzocht behandeld met oppervlakteactieve stoffen( detergentia) of met alcohol.
Voordelen van
De onmiskenbare voordelen van flowcytometrie kunnen worden beschouwd:
- Hoog( tot honderdduizend afleveringen per seconde) snelheid van analyse.
- Mogelijkheid om cellulaire subpopulaties te bepalen.
- Het vermogen om analyses uit te voeren van een groot aantal( tot 108 elementen in één ml dispersiemedium) van het aantal cellen.
- Mogelijkheid om de parameters van cellen en cellulaire structuren( inclusief zeldzame cellen) te bepalen.
- Hoge mate van objectiviteit bij het meten van de luminescentie-intensiteit( fluorescentie).
Waar aanvragen?
Het toepassingsgebied van flowcytometrie is ongebruikelijk breed. Het wordt zelfs in de industrie gebruikt om het productieproces te beheersen. We zullen dit aantonen door informatie in de vorm van lijsten ter verduidelijking te verstrekken.
In oncology
In dit gedeelte van de geneeskunde wordt flowcytometrie gebruikt om:
- intracellulaire structuren( DNA) te kwantificeren;
- -studie van de belangrijkste parameters van de celcyclus;
- identificatie en telling van cellen die tot verschillende perioden van de celcyclus behoren;
- -detectie van aneuploïde klonen( abnormale cellen met niet-standaard chromosoomset), indicatief voor de ontwikkeling van acute leukemie;
- die de mate van proliferatieve activiteit( neiging tot actieve deling) van aneuploïde klonen onthult;
- -detectie van tumormarkers;
- monitoring van de status van risicopatiënten;
- beoordeelt de werking van het immuunsysteem en de functionele consistentie van immuuncellen;
- -detectie van subpopulaties van lymfocyten( dit kenmerk maakt het mogelijk de toestand van immuniteit te beoordelen).
Video over flowcytometrie bij de diagnose van acute leukemie:
Immunologie
De flowcytometriewerkwijze maakt het volgende mogelijk:
- voor het uitvoeren van immunofenotypering( bepalen van het type en de functionele toestand) van bloedcellen;
- set fagocytische activiteit van immuuncellen( aangegeven bacteriën capture, gelabeld met fluorescerende kleurstoffen);
- identificeert intracellulaire eiwitten;
- bepalen de mate van proliferatieve activiteit;
- om de stadia van de celcyclus te onderzoeken;
- beoordelen van de mate van cytotoxiciteit cel( beschermend mechanisme om de subcellulaire niveau protozoa, bacteriën en virussen te vernietigen).Cytologie
Flow cytometry verschaft uitvoerige gegevens:
- nauwkeurig in te stellen cytomorfologische elke celeigenschappen( zijn grootte, de mate van asymmetrie is de verhouding tussen kern en cytoplasma);
- evalueert de activiteit van de enzymen die de cel vormen;
- analyseert de stadia van de celcyclus;
- meten intracellulaire fysiologische parameters( pH, de potentiaal van het celmembraan, de concentratie aan vrije ionen).
Hematologie met flowcytometrie kan hematologists:
- analyse subpopulaties van bloedcellen;
- de telling van de reticulocyten en bloedplaatjes met behulp van specifieke markers;
- beoordeelt de gevolgen van resterende( resterende, niet volledig genezen) ziekte;
- diagnosticeert acute leukemie;
- uitvoeren van een differentiële diagnose reactieve lymfocytose en lymfoproliferatieve aandoeningen( ziekten waarbij de aangetaste cellen met lymfoïde aard);
- voor het diagnosticeren van ziekten van lymfoproliferatieve etiologie.
Pharmaceuticals
Flow cytometrie helpt farmacologen:
- set expressieniveau( gevoeligheid van tumoren van verschillende lokalisaties behandelingsdrugs) eiwitmerkers;
- meet de activiteit van enzymen die de cellen vormen;
- bezig met de studie van de werking van bioactieve stoffen op de toestand van cellen van het menselijk lichaam, om elk stadium van de celcyclus te bepalen.
landbouw methode van flowcytometrie wordt veel gebruikt door wetenschappers die gespecialiseerd zijn in het kweken van nieuwe planten en dieren, want het te laat:
- bepalen ploïdie( aantal identieke sets chromosomen in de celkern) cellen;
- voert een analyse uit van elke fase van de celcyclus;
- voert de analyse uit van de inhoud van protoplasten( bacterie- of plantencellen) en sorteert ze ook volgens de ingestelde parameters.