Cytometria ilościowa jest stosunkowo nową techniką badania mikrobiologicznego środków dyspersyjnych, przeprowadzaną za pomocą specjalnego sprzętu. Cytometria jest statyczna i płynna.
Cytometrię statyczną wykonuje się przy użyciu mikroskopów konfokalnych;w przypadku ich braku, lekko zmodyfikowane mikroskopy luminescencyjne są wyposażone w proste i tanie systemy analizy obrazu.
Cytometria przepływowa jest wykonywana na specjalnych urządzeniach - sorterach i cytometrach przepływowych.
Oba warianty cytometrii ilościowych mają najszersze możliwe zastosowanie w praktyce badań medycznych i biologicznych. Pomimo różnicy w użytym materiale klinicznym i modelach eksperymentalnych, zadania, które rozwiązują, podlegają ogólnym zasadom badania.
Czym jest cytometria przepływowa?
Cytometria przepływowa jest techniką badania substancji dyspersyjnych w trybie analizy częściowej cząstek, które tworzą część fazy rozproszonej z sygnałów uzyskanych podczas fluorescencji i rozpraszania światła.
Technika cytometrii przepływowej została opracowana na podstawie specjalnych eksperymentów w celu określenia wielkości badanych cząstek i policzenia ich liczby.
pierwszy sorter komórka powstała w 1965 roku, ale od początku następnej dekady zorganizowano produkcję urządzeń do mierzenia intensywności fluorescencji w kilku długościach fali w celu określenia wielu parametrów badanej komórki.
dla badaczy Nowoczesne cytometrii przepływowej przyrządy używane są dwa typy:
- Przyrządy do pomiaru fluorescencji w dwóch( lub więcej) długości fal i rozpraszanie światła pod kątem dziesięciu( tak zwane małym kątem rozpraszania do przodu) a dziewięćdziesiąt stopni. Urządzenia tego typu są łatwe w użyciu.
- Dość nieporęczne sortowniki komórek, które mogą mierzyć więcej niż pięć parametrów badanych jąder lub cząstek, a także sortować komórki, które mają określony zestaw parametrów. Urządzenie
zaawansowanych cytometry przepływu są tak złożone i różnorodne, że trudno jest do każdego uogólnienie i systematyki, ale kilka ogólnych punktów, wspólnej dla wszystkich urządzeń, nadal istnieje:
- do analizy na cytometrze dowolnego typu wymaga jednorodnej zawiesiny komórek określonego rodzaju.
- Nie powinno być niedoboru liczby komórek lub ich jąder.
- Aby zapobiec zlepianiu się komórek, naukowiec musi mieć pełną informację o naturze rozpraszania światła i mieć tabele z odpowiednimi danymi.
Próbki
Podczas badań medycznych i biologicznych próbki przygotowano z komórek:
- szpiku kostnego;
- krew;
- płyn mózgowo-rdzeniowy( CSF);
- płynu maziowego( stawowego);
- płyn w jamie opłucnej;
- płyn jamy otrzewnowej gromadzący się w jamie brzusznej podczas rozwoju puchliny brzusznej;
- guza i zdrowych tkanek.
Zasada metody cytometrii przepływowej
Zasady leżące u podstaw procedury cytometrycznej są niezwykle proste.
Zawiesinę przygotowaną z komórek uprzednio znakowanych fluorescencyjnymi przeciwciałami monoklonalnymi lub fluorochromami umieszcza się w strumieniu ośrodka dyspersyjnego przepuszczonego przez komórkę przepływową.Hydrodynamiczne skupienie
zawiesiny komórek strumienia w strumień ośrodka dyspersyjnego, prowadzi do tego, że badane komórki lub ich jądra są umieszczone pojedynczo w tej kolejności belkę poprzeczną skupia światło( zazwyczaj) światło lasera.
Światło emitowane przez fluorochromy jest skupiane za pomocą układu optycznego składającego się z kilku lusterek i soczewek, a następnie rozłożone na określone składniki.
Otrzymane sygnały świetlne poddaje się analizie i przekształceniu w impulsy elektryczne, a następnie w pewne formy dopuszczalne do przetwarzania komputerowego i przechowywania odebranych informacji.
Fluorochromes
W celu ułatwienia procesu określania struktury komórkowej podczas procedury cytometrii przepływowej, stosowane medium dyspersyjne jest barwione specjalnymi barwnikami fluorescencyjnymi - fluorochromami.
Po takim traktowaniu, badane komórki nabywają zdolność do fluorescencji( blasku) pod wpływem wiązki promieni świetlnych.
Wybierając konkretny barwnik, stosuje się szereg kryteriów:
- Zastosowany fluorochrom musi być specyficzny dla danego DNA.
- Charakterystyki spektralne barwnika muszą odpowiadać możliwościom użytego sprzętu.
- Ważnym czynnikiem jest koszt fluorochromu( nie powinien być bardzo wysoki).
- Użyte barwniki powinny być łatwe w użyciu( mieć stabilność i dobrą rozpuszczalność).
Jednym z najpopularniejszych fluorochromów jest jodek propidyny: jego charakterystyka spektralna idealnie nadaje się do wykonywania cytometrii przepływowej.
Aby aktywować fluorescencję za pomocą jodku propidyny, badacze używają konwencjonalnego lasera argonowego( jego robocza długość fali wynosi 480 nm).Obszar sekcji fluorescencyjnej jest taki, że pozwala nam używać wyżej wymienionego fluorochromu do wykonywania pomiarów wieloparametrowych.
Do cytometrii przepływowej należy również zastosować: izocyjanian fluoresceiny
- ;
- fikoerytryny( Cy5, Cy7, czerwień Texan);
- alloficocyanin;
- Protein Peridinine-Chlorophyll.
Niezależnie od tego, który barwnik uczestniczy w procedurze, jego ilość powinna być wprost proporcjonalna do zawartości DNA w strukturze komórki.
Aby uzyskać wysokiej jakości zabarwienie wszystkich struktur komórkowych, ilość użytego fluorochromu musi być nadmierna.
Większość fluorochromów wchodzących w kontakt z DNA nie jest w stanie przejść przez błony nienaruszonych komórek. Aby zwiększyć przepuszczalność błon komórkowych, badane komórki są traktowane środkami powierzchniowo czynnymi( detergenty) lub alkoholem.
Zalety
Można zauważyć niewątpliwe zalety cytometrii przepływowej:
- Wysoki( do 10000 odcinków na sekundę) szybkość analizy.
- Zdolność do określania komórkowych subpopulacji.
- Zdolność do przeprowadzenia analizy ogromnej( do 108 elementów w jednym ml ośrodka dyspersyjnego) liczby komórek.
- Zdolność do określania parametrów dowolnych komórek i struktur komórkowych( w tym rzadkich).
- Wysoki stopień obiektywności w pomiarze natężenia luminescencji( fluorescencji).
Gdzie złożyć wniosek?
Widmo zastosowania cytometrii przepływowej jest niezwykle szerokie. Jest używany nawet w przemyśle do kontrolowania procesu produkcyjnego. Wykażemy to poprzez dostarczenie informacji w formie list dla jasności.
Onkologia
W tej części medycyny cytometrię przepływową stosuje się do:
- ilościowego określenia struktur wewnątrzkomórkowych( DNA);
- badania głównych parametrów cyklu komórkowego;
- identyfikacja i zliczanie komórek należących do różnych okresów cyklu komórkowego;
- wykrywanie klonów aneuploidalnych( nieprawidłowych komórek o nietypowym zestawie chromosomów), wskazujących na rozwój ostrej białaczki;
- ujawniający stopień aktywności proliferacyjnej( tendencja do aktywnego podziału) klonów aneuploidalnych;
- wykrywanie markerów nowotworowych;
- monitorowanie stanu pacjentów zagrożonych;
- ocena funkcjonowania układu odpornościowego i funkcjonalnej konsystencji komórek odpornościowych;
- wykrywanie subpopulacji limfocytów( ta charakterystyka pozwala na ocenę stanu odporności).
Wideo na temat cytometrii przepływowej w diagnostyce ostrej białaczki:
Immunologia
Metoda cytometrii przepływowej pozwala:
- do przeprowadzenia immunofenotypowania( określenie rodzaju i stanu funkcjonalnego) komórek krwi;
- ustala aktywność fagocytarną komórek odpornościowych( jest to wskazane przez wychwyt bakterii wyznakowanych barwnikami fluorescencyjnymi);
- identyfikuje białka wewnątrzkomórkowe;
- określa zakres aktywności proliferacyjnej;
- w celu zbadania etapów cyklu komórkowego;
- ocenia stopień cytotoksyczności( mechanizm ochronny, który pozwala na niszczenie pierwotniaków, bakterii i wirusów) na poziomie wewnątrzkomórkowym. Cytologia
Cytometria przepływowa zawiera obszerne dane:
- dokładnie ustawić Cytomorfologiczne jakichkolwiek cech komórek( jego rozmiar, stopień asymetrii stosunek jądra i cytoplazmy);
- ocenia aktywność enzymów tworzących komórkę;
- analizuje etapy cyklu komórkowego;
- mierzy fizjologiczne parametry wewnątrzkomórkowe( poziom pH, potencjał błony komórkowej, stężenie wolnych jonów).
Hematologia metodą cytometrii przepływowej można hematologów:
- analizy subpopulacje krwinek;
- do zliczania liczby retikulocytów i płytek za pomocą określonych markerów;
- ocenia skutki rezydualnej( rezydualnej, nie w pełni wyleczonej) choroby;
- diagnozuje ostrą białaczkę;
- wykonuje diagnostykę różnicową reaktywnej limfocytozy i chorób limfoproliferacyjnych( chorób, w których atakowane są komórki o charakterze limfoidalnym);
- do diagnozowania chorób związanych z etiologią limfoproliferacyjną.
farmaceutyczne
Cytometria przepływowa pomaga farmakologom:
- ustawić poziom ekspresji( wrażliwości nowotworu w różnych lokalizacjach leków terapeutycznych) markerów białkowych;
- mierzy aktywność enzymów tworzących komórki;
- zaangażował się w badanie działania substancji bioaktywnych na stan komórek ludzkiego ciała, aby określić dowolny etap cyklu komórkowego.
metoda rolnictwo
cytometrii przepływowej jest powszechnie stosowany przez naukowców specjalizujących się w hodowli nowych hodowli roślin i zwierząt, a to pozwala na:
- określić ploidii( liczba identycznych zestawów chromosomów w jądrze) komórki;
- przeprowadza analizę dowolnego etapu cyklu komórkowego;
- wykonuje analizę zawartości protoplastów( komórek bakteryjnych lub roślinnych), a także sortuje je według ustawionych parametrów.