Kvantitativní cytometrie je relativně novou technikou pro mikrobiologické vyšetření disperzních médií prováděnou pomocí speciálních zařízení.Cytometrie je statická a tekoucí.
Statická cytometrie se provádí pomocí konfokálních mikroskopů;v nepřítomnosti jsou mírně upravené luminiscenční mikroskopy vybaveny jednoduchými a levnými systémy analýzy obrazu.
Průtoková cytometrie se provádí na speciálních zařízeních - třídicích a průtokových cytometrech.
Obě varianty kvantitativní cytometrie mají co nejširší využití v praxi lékařského a biologického výzkumu. Přes rozdíly v použitém klinickém materiálu a experimentálních modelech, úkoly, které řeší, podléhají obecným zásadám studie.
Co je průtoková cytometrie?
průtokové cytometrie techniky zvané studie látek v režimu disperze Singler analyzovat částice obsahující disperzní fázi signálů došlým fluorescence a rozptylu světla.
Technika průtokové cytometrie byla vyvinuta na základě speciálních experimentů pro stanovení velikosti studovaných částic a počítání jejich počtu.
první tříděním buněk byl vytvořen v 1965 roce, ale od začátku příštího desetiletí byla uspořádána výroba zařízení pro měření intenzity fluorescence na několika vlnových délkách k určení více parametrů studovaného buňky.
pro výzkumné moderní průtokové cytometrie nástrojů se používají dva typy:
- přístroje pro měření fluorescence na dvou( nebo více) vlnových délek a rozptylu světla v úhlu deseti( tzv malý úhel vpřed rozptyl) a devadesát stupňů.Zařízení tohoto typu jsou snadno použitelná.
- Docela těžkopádné třídiče buněk, které mohou měřit více než pět parametrů zkoumaných jader nebo částic, a také třídit buňky, které mají určitou sadu parametrů.
zařízení pokročilé cytometrů proudění jsou tak složité a různorodé, že je obtížné, aby jakékoli zobecnění a systemizaci, ale několik obecných bodů, společný pro všechna zařízení, stále existuje:
- Pro analýzu na cytometru jakéhokoliv typu vyžaduje homogenní suspenze buněk určitého typu.
- Neexistuje žádný nedostatek počtu buněk nebo jejich jádra.
- Chcete-li zabránit tomu, aby se buňky spojily dohromady, musí mít výzkumník úplné informace o povaze rozptýlení světla a mít tabulky s příslušnými daty. Vzorky
Během lékařských a biologických studií byly odebrány vzorky z buněk:
- kostní dřeně;
- krve;
- cerebrospinální tekutina( CSF);
- synoviální( kloubní) tekutiny;Pleuralní tekutina
- ;
- peritoneální( ascites) tekutina se hromadí v břišní dutině během vývoje ascites;
- nádoru a zdravých tkání.
Princip metody průtokové cytometrie
Principy, které jsou základem cytometrického postupu, jsou extrémně jednoduché.
suspenze připravené z buněk předem označených fluorescenčními monoklonální protilátky nebo fluorochromy se umístí do proudu dispergačního média, přenášené skrz průtokovou komoru. Hydrodynamické zaostřování
buněčné suspenze proud do proudu dispergačního média vede k tomu, že zkoumané buňky nebo jejich jádra jsou uspořádány jednotlivě a v tomto pořadí příčný nosník zaměřuje světlo( typicky laser) světlo.
Světlo vycházející z fluorochromů je zaměřeno pomocí optického systému sestávajícího z několika zrcadel a čoček a následně rozloženo na určité součásti.
Přijaté světelné signály jsou podrobeny analýze a transformaci na elektrické impulsy a potom do určitých forem přijatelných pro počítačové zpracování a ukládání přijatých informací.
Fluorochromy
Za účelem usnadnění procesu stanovení buněčné struktury v průtokové cytometrie postupů používaných disperze střední barevný speciálním fluorescenčním barvivem - fluorochromy.
Po takovém ošetření získají testované buňky schopnost fluoresce( světlo) pod vlivem paprsku světelných paprsků.
Při výběru barvivo používá řady kritérií:
- fluorochromem by měla být použita specifická pro cílovou DNA.
- Spektrální charakteristiky barviva musí odpovídat schopnostem použitého zařízení.
- Důležitým faktorem je cena fluorochromu( neměla by být příliš vysoká).
- Použité barviva by měly být snadno použitelné( mají stabilitu a dobrou rozpustnost).
Jedním z nejpopulárnějších fluorochromy je propidium jodid: jeho spektrální charakteristiky jsou ideální pro průtokové cytometrie. Aktivace
fluorescence s použitím propidium jodidu, výzkumníci uchýlili k použití konvenčního argonového laseru( provozu její vlnová délka je 480 nm).Plocha fluorescenčního úseku je taková, že nám umožňuje použít výše zmíněný fluorochrom pro měření s více parametry.
Pro průtokovou cytometrii se také používá:
- fluorescein isothiokyanát;Phycoerythriny
- ( Cy5, Cy7, Texanová červená);
- alloficocyanin;
- Peridinin-Chlorophyll Protein.
Bez ohledu na to, které barvivo se podílí na postupu, jeho množství by mělo být přímo úměrné obsahu DNA v struktuře buněk.
Aby bylo dosaženo kvalitativního barvení všech buněčných struktur, množství fluorochromu musí být nadměrné.
Většina fluorochromů přicházejících do kontaktu s DNA není schopna projít membránami intaktních( neporušených) buněk. Pro zvýšení propustnosti buněčných membrán se vyšetřované buňky ošetřují povrchově aktivními látkami( detergenty) nebo alkoholem.
Výhody
nepochybné, mohou být považovány za výhody průtokové cytometrie:
- vysoká( až sto tisíc epizod za sekundu) rychlost analýzy.
- Schopnost stanovit buněčné subpopulace.
- Schopnost provést analýzu obrovských( až 108 prvků v jednom ml disperzního média) počtu buněk.
- Schopnost stanovit parametry všech buněk a buněčných struktur( včetně vzácných).
- Vysoký stupeň objektivity při měření intenzity luminiscence( fluorescence).
Kde se aplikuje?
Spektrum aplikace průtokové cytometrie je neobvykle široké.Používá se i v průmyslu pro řízení výrobního procesu. Ukážeme to tím, že poskytneme informace ve formě seznamů pro jasnost. V onkologii
proudit Tato část lék cytometrie se používá pro účely:
- kvantitativní analýzu intracelulárních struktur( DNA);
- studie hlavních parametrů buněčného cyklu;Identifikace
- a počítání buněk patřičných k různým časům buněčného cyklu;detekce
- aneuploidních klonů( abnormálních buněk s nestandardním sadu chromozomů), což ukazuje vývoj akutní leukémie;
- odhalující stupeň proliferační aktivity( tendence k aktivnímu rozdělení) aneuploidních klonů;
- detekce nádorových markerů;
- monitoruje stav ohrožených pacientů;
- hodnotí fungování imunitního systému a funkční konzistenci imunitních buněk;
- detekce subpopulací lymfocytů( tato charakteristika umožňuje posoudit stav imunity).
Video průtokové cytometrie v diagnostice akutní leukémie:
Immunology Průtoková cytometrie umožňuje:
- k provedení imunofenotypizace( určení typu a funkčního stavu) krevních buněk;
- stanovuje fagocytární aktivitu imunitních buněk( toto je indikováno zachycením bakterií značených fluorescenčními barvivy);
- identifikuje intracelulární proteiny;
- určuje rozsah proliferační aktivity;
- k prozkoumání fází buněčného cyklu;
- posoudit míru cytotoxicity( ochranný mechanismus zničit subcelulární úrovni pro prvoky, bakterie a viry) buňky. Cytologie
Průtoková cytometrie poskytuje komplexní data:
- přesně nastavit cytomorphological jakýchkoli buněk charakteristik( jeho velikost, úroveň asymetrie, poměr mezi jádrem a cytoplasmou);
- vyhodnocuje aktivitu enzymů tvořících buňku;
- analyzuje stadia buněčného cyklu;
- měří fyziologické intracelulární parametry( úroveň pH, potenciál buněčné membrány, koncentrace volných iontů).
hematologie pomocí průtokové cytometrie může hematologie:
- analyzovat subpopulací krvinek;
- pro počítání počtu retikulocytů a krevních destiček pomocí specifických markerů;
- posoudí důsledky zbytkové( zbytkové, ne zcela vyléčené) nemoci;
- diagnostikuje akutní leukémii;
- provádí diferenciální diagnostiku reaktivní lymfocytózy a lymfoproliferativních onemocnění( onemocnění, při kterých jsou postiženy buňky s lymfatickou povahou);
- k diagnostice onemocnění lymfoproliferační etiologie.
Pharmaceuticals
Průtoková cytometrie umožňuje pharmacologists:
- nastavit úroveň exprese( citlivost nádorů různých lokalizacích léčba léky) proteinových markerů;
- měří aktivitu enzymů tvořících buňky;
- zabývající se studiem působení bioaktivních látek ve stavu těla lidských buněk pro stanovení jakékoli fázi buněčného cyklu.
zemědělství
metoda průtokové cytometrie je široce používán vědci specializující se na šlechtění nových šlechtění rostlin a zvířat, jako ti na to umožňuje:
- určení ploidie( počet identických chromozomálních sad v jádru buňky);
- provádí analýzu libovolné fáze buněčného cyklu;
- provádět analýzu obsahu protoplastů( bakteriálních nebo rostlinných buněk), a třídění jejich výrobě podle předem stanovených parametrů.