provodi se pomoću konfokalnih mikroskopa;u nedostatku njih, malo promijenjene svjetleće mikroskope opremljene su jednostavnim i jeftinim sustavima analize slike.
Protočna citometrija se provodi na posebnim uređajima - citometrom za sortiranje i protok.
Obje varijante kvantitativne citometrije imaju najširu moguću primjenu u praksi medicinskih i bioloških istraživanja. Unatoč razlikama u korištenom kliničkom materijalu i eksperimentalnim modelima, zadatke koje rješavaju podložni su općim načelima studije.
Što je protočna citometrija?
protočna citometrija tehnika naziva studija tvari u modu disperzija singler analiziraju čestice sadrže disperznu fazu signala primljenih na fluorescentnom i raspršenog svjetla.
Tehnika protočne citometrije razvijena je na osnovi posebnih eksperimenata za određivanje veličine čestica u studiji i njihova brojanja.
prva stanica razvrstavanja je izrađen u 1965 godini, ali od početka sljedećeg desetljeća je uređen proizvodnju uređaja za mjerenje intenziteta fluorescencije na nekoliko valnih duljina kako bi se utvrdilo više parametara istraživanog stanice.
za istraživače suvremene protočne citometrije instrumenata koriste se dvije vrste:
- Instrumenti za mjerenje fluorescencije na dva( ili više) valnih duljina i rasipanja svjetlosti pod kutom od deset( tzv mali kut naprijed raspršenje) i devedeset stupnjeva. Uređaji ovog tipa su jednostavni za upotrebu.
- Prilično težak stanični sorteri koji mogu mjeriti više od pet parametara ispitivanih jezgri ili čestica, kao i sortirati stanice koje imaju određeni skup parametara.
uređaja napredne citometri protoka toliko su složeni i raznoliki da je teško bilo generalizacije i sistematizaciji, ali nekoliko općih točaka, zajednički svim uređajima, i dalje postoji:
- Za analizu na citometruje bilo koje vrste zahtijeva homogene suspenzije stanica određene vrste.
- Ne bi trebalo biti nedostatka broja ćelija ili njihovih jezgri.
- Kako bi se spriječile da se stanice neprilagođaju, istraživač mora imati potpune informacije o prirodi raspršenja svjetlosti i imati tablice s relevantnim podacima.
Uzorci
Tijekom medicinskih i bioloških istraživanja, uzorci pripravljeni iz stanica:
- koštane srži;
- krv;
- cerebrospinalna tekućina( CSF);
- sinovijalne( zglobne) tekućine;
- pleuralna tekućina;
- peritonealna( ascites) tekućina akumulira u abdominalnoj šupljini tijekom razvoja ascitesa;
- tumora i zdravih tkiva.
Princip metode protočne citometrije
Načela koja se temelje na citometrijskom postupku iznimno su jednostavna.
suspenzije dobije se iz stanica koje su prethodno obilježene s fluorescentnim monoklonska protutijela ili fluorokromima se nalazi u protoku disperzijskom mediju, koji se prenosi kroz protočnu ćeliju. Hidrodinamički fokusiranje
stanica suspenzije mlaza u struji disperzijskom mediju dovodi do toga da su stanice ili njihove ispitivane jezgre postavljeni pojedinačno i u tom cilju lijeve zraka usmjerena svjetlost lasera( tipično) svjetlo.
Svjetlo koje dolazi iz fluorohroma usmjereno je optičkim sustavom koji se sastoji od nekoliko zrcala i leća, a zatim se razgrađuje u određene komponente.
Primljeni signali svjetla podvrgavaju se analizi i transformaciji u električne impulse, a zatim na određene oblike prihvatljive za obradu računala i pohranu primljenih informacija.
Fluorochromes
Kako bi se olakšao proces određivanja staničnih struktura tijekom postupka protočne citometrije, korišten disperzijski medij zatamnjen je s posebnim fluorescentnim bojama - fluorokromima.
Nakon takvog liječenja, stanice pod testom stječu sposobnost fluorescije( svjetlosti) pod utjecajem svjetlosnih zraka.
Pri odabiru boje koristi se brojni kriterij:
- Koristi se fluorochrom mora biti specifičan za DNA koja se istražuje.
- Spektralna svojstva boje moraju odgovarati sposobnostima korištene opreme.
- Važan faktor je trošak fluorochroma( ne bi trebao biti vrlo visok).
- Boje koje se koriste moraju biti jednostavne za upotrebu( imaju stabilnost i dobra topljivost).
Jedan od najpopularnijih fluorokroma je propidij jodid: njegove spektralne osobine pogodne su za izvođenje protočne citometrije.
Za aktiviranje fluorescencije pomoću propidij jodida, istraživači koriste konvencionalni argonski laser( njegova radna valna duljina je 480 nm).Područje fluorescentnog odjeljka je takvo da nam omogućuje da koristimo gore spomenuti fluorokrom za izvođenje višeparametarnih mjerenja.
Za protočnu citometrija, također se koristi:
- fluorescein izotiocijanat;
- fikoeritrini( Cy5, Cy7, texans crveno);
- alloficocyanin;
- Protein peridinin-klorofila.
Bez obzira na boju koja je uključena u postupak, njezina bi količina trebala biti izravno proporcionalna sadržaju DNK u staničnoj strukturi.
Da bi se postigla kvalitativna bojanja svih staničnih struktura, količina fluoro-kroma koja se koristi mora biti prekomjerna.
Većina fluorokroma koji dolaze u dodir s DNA ne mogu proći kroz membrane intaktnih( netaknutih) stanica. Kako bi se povećala propusnost staničnih membrana, stanice pod istragom se tretiraju s tenzidima( deterdžentima) ili sa alkoholom.
Prednosti
Nedvojbene prednosti protočne citometrije mogu se razmotriti:
- Visoki( do sto tisuća epizoda u sekundi) brzina analize.
- Sposobnost određivanja staničnih subpopulacija.
- Sposobnost izvođenja analize ogromnog( do 108 elemenata u 1 ml disperzijskog medija) broja stanica.
- Sposobnost određivanja parametara bilo koje stanice i staničnih struktura( uključujući rijetke).
- Visoki stupanj objektivnosti u mjerenju intenziteta luminescencije( fluorescencija).
Gdje se prijaviti?
Spektar primjene protočne citometrije je neuobičajeno širok. Koristi se čak iu industriji za kontrolu proizvodnog procesa. To ćemo demonstrirati pružanjem informacija u obliku popisa za jasnoću.
U onkologiji
U ovom dijelu lijeka, protočna citometrija se koristi za:
- kvantificirati unutarstanične strukture( DNA);
- studija glavnih parametara staničnog ciklusa;Identifikacija i brojanje
- stanica koje pripadaju različitim razdobljima staničnog ciklusa;
- detekcija aneuploidnih klonova( abnormalne stanice s nestandardnim skupom kromosoma), što ukazuje na razvoj akutne leukemije;
- otkriva stupanj proliferativne aktivnosti( tendencija prema aktivnoj podjeli) aneuploidnih klonova;
- detekcija tumorskih markera;
- praćenje stanja pacijenata u opasnosti;
- procjenjuje funkcioniranje imunološkog sustava i funkcionalnu konzistenciju imunoloških stanica;
- detekcija subpopulacija limfocita( ova karakteristika omogućuje procjenu stanja imunosti).
Video na protoku citometrije u dijagnostici akutne leukemije:
imunologija
Metoda protočne citometrije omogućuje:
- za obavljanje imunofenotipizacije( odrediti tip i funkcionalno stanje) krvnih stanica;
- postavljen Fagocitne aktivnost imunosnih stanica( označen bakterija hvatanje, označenih s fluorescentne boje);
- identificira intracelularne proteine;
- određuje opseg proliferativne aktivnosti;
- za ispitivanje stadija staničnog ciklusa;
- procijenio stupanj citotoksičnosti( zaštitni mehanizam uništiti substaničnog razinu na protozoe, bakterije i viruse) stanice. Citologija
protočnom citometrijom osigurava podatke za opsežne:
- točno postavljen cytomorphological bilo karakteristika stanica( njegovu veličinu, razina asimetrije, omjer između jezgre i citoplazme);
- procjenjuje aktivnost enzima koji čine stanicu;
- analizira faze ciklusa stanica;
- mjeri unutarstaničnu fiziološke parametre( pH vrijednost, potencijala stanične membrane, koncentracija slobodnih iona).
Hematologija protočnom citometrijom može hematolozi:
- analizirati subpopulacije krvnih stanica;
- računati broj retikulocita i trombocita pomoću specifičnih markera;
- procijeniti posljedice preostale( preostale, ne potpuno ozdravljene) bolesti;
- dijagnosticira akutnu leukemiju;
- izvesti diferencijalna dijagnoza reaktivni limfocitoza i Limfoproliferacijski bolesti( bolesti u kojima su stanice koje imaju pogođenim limfnog prirode);
- za dijagnosticiranje bolesti limfoproliferativne etiologije.
Pharmaceuticals
Flow citometrija omogućuje farmakolozi:
- postavljena razina ekspresije( osjetljivost tumora različitih lijekova za liječenje lokalizacije) proteinskih markera;
- mjeri aktivnost enzima koji čine stanice;
- bavi proučavanjem djelovanje bioaktivnih tvari u organizmu stanju ljudskih stanica kako bi se utvrdilo bilo staničnog ciklusa pozornici.
poljoprivreda
metoda protočne citometrije je naširoko koristi od strane znanstvenika specijaliziranih za uzgoj novog biljnog i životinjskog uzgoja, jer vas da omogućuje:
- odrediti ploidiju( broj identičnih kromosoma skupova u jezgri) stanica;
- obavlja analizu bilo kojeg stadija staničnog ciklusa;
- obavljanje analize sadržaja protoplasta( bakterijske ili biljne stanice), te razvrstavanje ih proizvode u skladu s unaprijed određenim parametrima.